sdjisafhshfuk's blog
Principaux conducteurs d'immigrants du marché de l'habitation Metro Van
Le géographe Daniel Hiebert a découvert que les Chinois et les Asiatiques du Sud deviennent propriétaires à un taux beaucoup plus élevé que les autres immigrants et la population en général.
Est certainement un impact sur le marché du logement, a déclaré Hiebert, qui croit un facteur clé derrière le phénomène, c'est que de nombreux nouveaux immigrants arrivent dans les grandes villes du Canada avec beaucoup d'argent.
Le chercheur expérimenté, le tableau croisé exclusif des données sur le logement et l'immigration couvrant 2006 à 2011, a révélé qu'en moyenne, 53% des immigrants à Metro Vancouver au cours de ces cinq années sont devenus des propriétaires pendant cette période.
Ils ont acheté environ 100 000 foyers dans le métro Vancouver pendant les cinq années, allant des condos de banlieue aux demeures urbaines.
Les immigrants chinois étaient au sommet de tout cela. Naturellement, leur taux d'accession à la propriété était de 73 p. 100, a déclaré Hiebert.
CONNEXION: Des milliers de propriétaires de manoirs Metro Vancouver évitant les taxes
Il y a ensuite le style de Burnaby
La croissance rapide des économies ethniques
Environ 52% des Sud-Asiatiques nouvellement arrivés, le deuxième groupe d'immigrants les plus importants de Metro Vancouver, ont acheté des maisons dans cette même période de cinq ans.
Le taux d'achat de logements chez les Sud-Coréens était de 51 pour cent.
En remontant les cinq plus récents groupes récents de nouveaux arrivants au cours de cette période, le taux chez les immigrants blancs et philippins était d'environ 44% environ.
Hiebert, qui a publié des études majeures sur l'immigration, le logement et les enclaves ethniques,rolex datejust 36 mm contrefaçon, estime que les immigrants affectent sérieusement l'accessibilité au logement à la fois aux extrémités haut et bas du marché.
Les prix des propriétés coûteuses de Metro Vancouver dans la gamme de 4 millions de dollars supplémentaires sont considérablement affectés par les immigrants, a déclaré Hiebert. Mais, à l'extrémité inférieure, les coûts pour les nouvelles familles de réfugiés syriens, qui ont besoin de subventions gouvernementales pour se doter d'un lieu de base pour vivre.
Alors que certains des nouveaux immigrants qui finissent par être classés comme propriétaires pourraient être parmi les relativement peu nombreux qui arrivent dans un programme de réunification familiale et se joignent à un ménage existant, Hiebert croit que la plupart achèteraient des maisons en transférant de grandes ressources financières au Canada.
Pense que ce serait un assez grosse étirement pour quelqu'un d'arriver à tabula rasa (sans beaucoup d'argent) dans un marché du logement comme Vancouver et dans les cinq ans, être en mesure d'acheter une maison dans ce lieu. Ce serait vraiment difficile à attendre, at-il dit.
Le professeur instruit à Oxford a trouvé ce qu'il a appelé une corrélation décisive entre la haute immigration et le métro Vancouver et les prix élevés des maisons.
Le taux global d'accession à la propriété parmi tous les résidents de Metro Vancouver est de près de 70 pour cent sur un total de 1,5 million de ménages, selon le travail de Hiebert.
Basé uniquement sur le statut de minorité visible et en ignorant le statut d'immigrant, l'appartenance ethnique a le plus haut taux d'accession à la propriété, suivie par les Asiatiques du Sud, a déclaré M. Hiebert.
Le pourcentage d'accession à la propriété chez les Chinois est de 81 p. 100, ce qui représente 290 000 ménages du Métro, a déclaré Hiebert. Les Sud-Asiatiques occupent le deuxième rang à 75%,rolex datejust femme faux, soit environ 160 000 ménages.
Ces deux plus grands groupes, vous avez une grande partie de l'image d'immigrés, c'est pourquoi l'image de l'immigrant semble meilleure que l'autre photo (pour les non-immigrants), a déclaré Hiebert.
Parmi les groupes ethniques plus petits de Metro Vancouver, 62% des maisons propres aux Philippines, de même que 59% des Asiatiques de l'Ouest (principalement des Iraniens).
Hiebert, qui conseille fréquemment le gouvernement fédéral, a déclaré que sa recherche ne comprenait pas d'étudier le taux d'accession à la propriété chez les non immigrants, les résidents de longue date du Canada ou les Blancs. Il ne se penche pas non plus sur les effets spécifiques de la propriété étrangère sur les coûts de logement de Metro Vancouver.
Et même si Hiebert a déclaré que le taux élevé d'accession à la propriété chez les immigrants a un impact sur le logement,rolex oyster perpetual datejust contrefaçon, il a déclaré qu'une analyse plus minutieuse des ventes était nécessaire pour le mesurer précisément.
Il a spéculé que les quelque 100 000 maisons achetées rapidement par les immigrants qui sont arrivés à Metro Vancouver entre 2006 et 2011 représenteraient une fraction de toutes les maisons vendues au cours de cette période, ajoutant que cette proportion pourrait être calculée après avoir appris combien de maisons vendent chaque année dans la région.
Craig Munn, porte-parole du Conseil immobilier du Grand Vancouver, a déclaré dans une interview que le nombre moyen de maisons vendues entre 2006 et 2011 dans la région de Metro Vancouver (qui comprend 21 municipalités de West Vancouver à Langley) était d'environ 44 000 par an.
Cela représente jusqu'à 220 000 ventes de maisons au cours de cette période de cinq ans, ce qui signifie que la proportion d'immigrants qui sont arrivés à ce moment-là serait d'environ 45 p. 100.
Hiebert,rolex perpetual datejust contrefaçon, en basant son travail sur de nouveaux tableaux croisés de l'Enquête nationale auprès des ménages, a trouvé des différences dans les taux de propriété des immigrants de nouveaux immigrants entre les trois plus grandes villes du Canada.
Le géographe Daniel Hiebert a découvert que les Chinois et les Asiatiques du Sud deviennent propriétaires à un taux beaucoup plus élevé que les autres immigrants et la population en général.
Est certainement un impact sur le marché du logement, a déclaré Hiebert, qui croit un facteur clé derrière le phénomène, c'est que de nombreux nouveaux immigrants arrivent dans les grandes villes du Canada avec beaucoup d'argent.
Le chercheur expérimenté, le tableau croisé exclusif des données sur le logement et l'immigration couvrant 2006 à 2011, a révélé qu'en moyenne, 53% des immigrants à Metro Vancouver au cours de ces cinq années sont devenus des propriétaires pendant cette période.
Ils ont acheté environ 100 000 foyers dans le métro Vancouver pendant les cinq années, allant des condos de banlieue aux demeures urbaines.
Les immigrants chinois étaient au sommet de tout cela. Naturellement, leur taux d'accession à la propriété était de 73 p. 100, a déclaré Hiebert.
CONNEXION: Des milliers de propriétaires de manoirs Metro Vancouver évitant les taxes
Il y a ensuite le style de Burnaby
La croissance rapide des économies ethniques
Environ 52% des Sud-Asiatiques nouvellement arrivés, le deuxième groupe d'immigrants les plus importants de Metro Vancouver, ont acheté des maisons dans cette même période de cinq ans.
Le taux d'achat de logements chez les Sud-Coréens était de 51 pour cent.
En remontant les cinq plus récents groupes récents de nouveaux arrivants au cours de cette période, le taux chez les immigrants blancs et philippins était d'environ 44% environ.
Hiebert, qui a publié des études majeures sur l'immigration, le logement et les enclaves ethniques,rolex datejust 36 mm contrefaçon, estime que les immigrants affectent sérieusement l'accessibilité au logement à la fois aux extrémités haut et bas du marché.
Les prix des propriétés coûteuses de Metro Vancouver dans la gamme de 4 millions de dollars supplémentaires sont considérablement affectés par les immigrants, a déclaré Hiebert. Mais, à l'extrémité inférieure, les coûts pour les nouvelles familles de réfugiés syriens, qui ont besoin de subventions gouvernementales pour se doter d'un lieu de base pour vivre.
Alors que certains des nouveaux immigrants qui finissent par être classés comme propriétaires pourraient être parmi les relativement peu nombreux qui arrivent dans un programme de réunification familiale et se joignent à un ménage existant, Hiebert croit que la plupart achèteraient des maisons en transférant de grandes ressources financières au Canada.
Pense que ce serait un assez grosse étirement pour quelqu'un d'arriver à tabula rasa (sans beaucoup d'argent) dans un marché du logement comme Vancouver et dans les cinq ans, être en mesure d'acheter une maison dans ce lieu. Ce serait vraiment difficile à attendre, at-il dit.
Le professeur instruit à Oxford a trouvé ce qu'il a appelé une corrélation décisive entre la haute immigration et le métro Vancouver et les prix élevés des maisons.
Le taux global d'accession à la propriété parmi tous les résidents de Metro Vancouver est de près de 70 pour cent sur un total de 1,5 million de ménages, selon le travail de Hiebert.
Basé uniquement sur le statut de minorité visible et en ignorant le statut d'immigrant, l'appartenance ethnique a le plus haut taux d'accession à la propriété, suivie par les Asiatiques du Sud, a déclaré M. Hiebert.
Le pourcentage d'accession à la propriété chez les Chinois est de 81 p. 100, ce qui représente 290 000 ménages du Métro, a déclaré Hiebert. Les Sud-Asiatiques occupent le deuxième rang à 75%,rolex datejust femme faux, soit environ 160 000 ménages.
Ces deux plus grands groupes, vous avez une grande partie de l'image d'immigrés, c'est pourquoi l'image de l'immigrant semble meilleure que l'autre photo (pour les non-immigrants), a déclaré Hiebert.
Parmi les groupes ethniques plus petits de Metro Vancouver, 62% des maisons propres aux Philippines, de même que 59% des Asiatiques de l'Ouest (principalement des Iraniens).
Hiebert, qui conseille fréquemment le gouvernement fédéral, a déclaré que sa recherche ne comprenait pas d'étudier le taux d'accession à la propriété chez les non immigrants, les résidents de longue date du Canada ou les Blancs. Il ne se penche pas non plus sur les effets spécifiques de la propriété étrangère sur les coûts de logement de Metro Vancouver.
Et même si Hiebert a déclaré que le taux élevé d'accession à la propriété chez les immigrants a un impact sur le logement,rolex oyster perpetual datejust contrefaçon, il a déclaré qu'une analyse plus minutieuse des ventes était nécessaire pour le mesurer précisément.
Il a spéculé que les quelque 100 000 maisons achetées rapidement par les immigrants qui sont arrivés à Metro Vancouver entre 2006 et 2011 représenteraient une fraction de toutes les maisons vendues au cours de cette période, ajoutant que cette proportion pourrait être calculée après avoir appris combien de maisons vendent chaque année dans la région.
Craig Munn, porte-parole du Conseil immobilier du Grand Vancouver, a déclaré dans une interview que le nombre moyen de maisons vendues entre 2006 et 2011 dans la région de Metro Vancouver (qui comprend 21 municipalités de West Vancouver à Langley) était d'environ 44 000 par an.
Cela représente jusqu'à 220 000 ventes de maisons au cours de cette période de cinq ans, ce qui signifie que la proportion d'immigrants qui sont arrivés à ce moment-là serait d'environ 45 p. 100.
Hiebert,rolex perpetual datejust contrefaçon, en basant son travail sur de nouveaux tableaux croisés de l'Enquête nationale auprès des ménages, a trouvé des différences dans les taux de propriété des immigrants de nouveaux immigrants entre les trois plus grandes villes du Canada.
Lizzie Armitstead manque alors que Anna van der Breggen gagne de l'or après l'arrêt Annemiek van Vleuten,contrefaçon datejust or rose
La championne du monde Lizzie Armitstead s'est épargnée un examen minutieux aux Jeux olympiques, se terminant seulement le cinquième dans une course routière féminine qui a laissé un coureur hollandais inconscient et un autre, Anna van der Breggen, s'accrochant à l'or.
Même cela était un résultat trop bon pour ceux qui n'auraient pas eu Armitstead n'importe où près de la participation olympique suite à l'imbroglio de ses trois tests de drogue manqués,montre rolex datejust occasion contrefaçon.
Armitstead est resté défiant face à la critique continue, notamment par beaucoup de ses rivaux dans le peloton, mais a admis que le traumatisme des dernières semaines l'avait rendu «un zombie» parfois.
'Je ne peux pas me sentir désolé. C'est le sport et c'est de quoi il s'agit. Vous vous ouvrez le jugement. Je n'ai jamais abandonné et pour cela je peux être fier de moi-même. Évidemment, j'ai perdu beaucoup de sommeil et ce fut un moment difficile, mais ce n'est pas une excuse ', a-t-elle déclaré.
'Une fois que j'ai un chiffre sur le dos,contrefaçon rolex datejust lady 31, je suis une personne totalement différente et je suis concentré et il ne m'a pas pris conscience une fois dans la course. J'étais totalement concentré sur ce que je fais le mieux, qui est mon vélo rapidement.'
Chris Boardman,contrefaçon rolex datejust or et acier, expert de la BBC, a remis en question la sécurité du parcours en descente à Vista Chinesa qui a vu Annemiek van Vleuten frapper inconscient dans un accident horrible tout en menant la poursuite de l'or.
'Je suis vraiment très fâché parce que j'ai regardé les meubles de la route et je pensais que personne ne pouvait s'écraser ici et se lever. C'était bien passé technique, c'était dangereux ', a-t-il déclaré.
L'équipe GB était l'une des dernières unités à atteindre la ligne de départ. L'examen immédiatement est tombé sur Armitstead, un caméraman stationné sur sa gauche alors que l'horloge a diminué. Elle a fait de son mieux pour se concentrer.
Il y a eu des échanges nerveux avec le coéquipier Nikki Harris à son droit et un sourire pour reconnaître les cris épisodiques de 'Go Lizzie' de la cabale serrée de la famille et des amis dans la foule.
Il y avait aussi du théâtre tôt, lorsque Armitstead, qui autrement, a subi une crevaison dans les 10 premiers kilomètres. Le retard subséquent attendant la livraison d'un vélo de remplacement obligeait Armitstead à se pencher sur la poursuite de son groupe, tout comme l'équipe d'équipe, Emma Pooley, a tendu le peloton à la tête de la course.
La convention dicte un coéquipier qui retombe pour aider les personnes frappées. Étant donné qu'il n'y a pas de contact radio entre l'équipe et le cavalier, il n'y avait aucun signe de Harris, un détail qui a révélé ce qui ressemblait à une réprimande rigoureuse d'Arméstead quand elle a finalement rejoint le groupe.
Le pic de chaleur qui a éclaté dans la course de l'homme a retombé à des températures saisonnières dans les années 20 inférieures lorsque le peloton a été propulsé vers la dernière montée du jour, Vista Chinesa, à la dernière heure du concours.
De même que cette même colline a décidé le résultat de la course masculine, elle a également déterminé les espoirs de la médaille parmi les femmes, avec la complication supplémentaire de la bruine dans la descente alignée.
Van Vleuten a mangé le sol sous sa camionnette jusqu'à ce qu'elle l'ait mangé, en la posant sur le guidon et péniblement hors de la course. Elle resta immobile pour une période dégoûtante, mais la Fédération néerlandaise de cyclisme a confirmé plus tard que Van Vleuren était conscient et «OK», mais devait être emmenée à l'hôpital.
Mara Abbott des États-Unis a été laissée 23 secondes à l'avance et a regardé le gagnant probable jusqu'à trois kilomètres final lorsque le trio derrière a commencé sa poursuite inexorable.
Cette explosion tardive de la ligne est l'un des meilleurs cadeaux du cyclisme routier pour le sport. Abbott a manqué de jambes dans les 1000 mètres finaux alors que le trio bête derrière gorgé de sa fatigue.
Armitstead avait espéré être parmi le pack prédateur, mais finalement s'est laissé trop faire pour faire la dernière section définitive de huit kilomètres d'un parcours de test.
Cliquez sur l'icône Adblock / Adblock Plus, qui se trouve à droite de votre barre d'adresse.
Sur Adblock, cliquez sur 'Don' t s'exécute sur des pages sur ce domaine '.
Si vous êtes Parcourir Privé dans Firefox, 'Protection de Suivi' peut entraîner l'affichage de l'avis de publication. Il peut être temporairement désactivé en cliquant sur l'icône 'shield' dans la barre d'adresse.
La championne du monde Lizzie Armitstead s'est épargnée un examen minutieux aux Jeux olympiques, se terminant seulement le cinquième dans une course routière féminine qui a laissé un coureur hollandais inconscient et un autre, Anna van der Breggen, s'accrochant à l'or.
Même cela était un résultat trop bon pour ceux qui n'auraient pas eu Armitstead n'importe où près de la participation olympique suite à l'imbroglio de ses trois tests de drogue manqués,montre rolex datejust occasion contrefaçon.
Armitstead est resté défiant face à la critique continue, notamment par beaucoup de ses rivaux dans le peloton, mais a admis que le traumatisme des dernières semaines l'avait rendu «un zombie» parfois.
'Je ne peux pas me sentir désolé. C'est le sport et c'est de quoi il s'agit. Vous vous ouvrez le jugement. Je n'ai jamais abandonné et pour cela je peux être fier de moi-même. Évidemment, j'ai perdu beaucoup de sommeil et ce fut un moment difficile, mais ce n'est pas une excuse ', a-t-elle déclaré.
'Une fois que j'ai un chiffre sur le dos,contrefaçon rolex datejust lady 31, je suis une personne totalement différente et je suis concentré et il ne m'a pas pris conscience une fois dans la course. J'étais totalement concentré sur ce que je fais le mieux, qui est mon vélo rapidement.'
Chris Boardman,contrefaçon rolex datejust or et acier, expert de la BBC, a remis en question la sécurité du parcours en descente à Vista Chinesa qui a vu Annemiek van Vleuten frapper inconscient dans un accident horrible tout en menant la poursuite de l'or.
'Je suis vraiment très fâché parce que j'ai regardé les meubles de la route et je pensais que personne ne pouvait s'écraser ici et se lever. C'était bien passé technique, c'était dangereux ', a-t-il déclaré.
L'équipe GB était l'une des dernières unités à atteindre la ligne de départ. L'examen immédiatement est tombé sur Armitstead, un caméraman stationné sur sa gauche alors que l'horloge a diminué. Elle a fait de son mieux pour se concentrer.
Il y a eu des échanges nerveux avec le coéquipier Nikki Harris à son droit et un sourire pour reconnaître les cris épisodiques de 'Go Lizzie' de la cabale serrée de la famille et des amis dans la foule.
Il y avait aussi du théâtre tôt, lorsque Armitstead, qui autrement, a subi une crevaison dans les 10 premiers kilomètres. Le retard subséquent attendant la livraison d'un vélo de remplacement obligeait Armitstead à se pencher sur la poursuite de son groupe, tout comme l'équipe d'équipe, Emma Pooley, a tendu le peloton à la tête de la course.
La convention dicte un coéquipier qui retombe pour aider les personnes frappées. Étant donné qu'il n'y a pas de contact radio entre l'équipe et le cavalier, il n'y avait aucun signe de Harris, un détail qui a révélé ce qui ressemblait à une réprimande rigoureuse d'Arméstead quand elle a finalement rejoint le groupe.
Le pic de chaleur qui a éclaté dans la course de l'homme a retombé à des températures saisonnières dans les années 20 inférieures lorsque le peloton a été propulsé vers la dernière montée du jour, Vista Chinesa, à la dernière heure du concours.
De même que cette même colline a décidé le résultat de la course masculine, elle a également déterminé les espoirs de la médaille parmi les femmes, avec la complication supplémentaire de la bruine dans la descente alignée.
Van Vleuten a mangé le sol sous sa camionnette jusqu'à ce qu'elle l'ait mangé, en la posant sur le guidon et péniblement hors de la course. Elle resta immobile pour une période dégoûtante, mais la Fédération néerlandaise de cyclisme a confirmé plus tard que Van Vleuren était conscient et «OK», mais devait être emmenée à l'hôpital.
Mara Abbott des États-Unis a été laissée 23 secondes à l'avance et a regardé le gagnant probable jusqu'à trois kilomètres final lorsque le trio derrière a commencé sa poursuite inexorable.
Cette explosion tardive de la ligne est l'un des meilleurs cadeaux du cyclisme routier pour le sport. Abbott a manqué de jambes dans les 1000 mètres finaux alors que le trio bête derrière gorgé de sa fatigue.
Armitstead avait espéré être parmi le pack prédateur, mais finalement s'est laissé trop faire pour faire la dernière section définitive de huit kilomètres d'un parcours de test.
Cliquez sur l'icône Adblock / Adblock Plus, qui se trouve à droite de votre barre d'adresse.
Sur Adblock, cliquez sur 'Don' t s'exécute sur des pages sur ce domaine '.
Si vous êtes Parcourir Privé dans Firefox, 'Protection de Suivi' peut entraîner l'affichage de l'avis de publication. Il peut être temporairement désactivé en cliquant sur l'icône 'shield' dans la barre d'adresse.
Madonna the mystic
Madonna voulait voir Israël et les Israéliens avaient envie de voir Madonna. Mais à la fin, chacun n'a réussi à apercevoir l'autre. Elle est venue avec quelque 2 000 camarades de cabala, une forme de mysticisme juif,contrefaçon rolex datejust fond bleu, et a passé la plupart de ses cinq jours ici dans l'hôtel David Inter Continental, en face de la plage. Un grand nombre d'adorateurs participaient à des prières liées à la nouvelle année juive,rolex oyster perpetual datejust femme contrefaçon, qui est tombée la semaine dernière. Plusieurs dizaines de photographes rôdaient les terrains. Madonna regarda les fenêtres sombres de sa camionnette pendant plusieurs minutes alors que la foule se rassemblait. La camionnette a ensuite chassé sans Madonna en ouvrant la porte.
Les Israéliens séculiers ont été affamés pour de grands noms d'actes internationaux ces dernières années et étaient prêts à embrasser Madonna, qui a chanté ici en 1993. Mais elle est venu prier pour ne pas jouer. Elle et son mari, le cinéaste britannique Guy Ritchie, ont participé à des séances de cabales dans la salle de conférence de l'hôtel, qui a été transformée en synagogue, avec des sections séparées d'hommes et de femmes.
La seule apparition publique officielle de Madonna est venue dimanche soir, lorsque le centre de Kabbalah basé à Los Angeles, qui a organisé le voyage, a organisé un programme pour enfants à l'hôtel qui présentait des jeunes juifs et arabes et a attiré plus de 1 000 invités, dont le gouvernement israélien Les officiels.
J'étais un peu hésitant à venir ici après avoir vu tant de nouvelles sur les attaques terroristes ', a déclaré Madonna, portant une robe découpée avec un imprimé léopard noir et blanc. Je me rends compte maintenant qu'il n'est plus dangereux d'être ici que de l'être à New York. ''
Madonna explore la cabala depuis 1997 et s'habille maintenant et joue souvent avec des symboles du judaïsme et de la cabale. Elle porte parfois une étoile de David et a souvent un fil rouge sur son poignet, une marque de commerce de cabala destinée à écarter le mauvais œil. Quand elle a visité un restaurant de Tel Aviv, elle portait un collier brillant avec une grande lettre E, apparemment une référence à sa récente adaptation du nom juif biblique Esther.
Mais Madonna a dit qu'elle ne représentait pas une religion. Je suis ici en tant qu'étudiant de cabala ', at-elle dit.' Un cabaliste voit le monde comme un tout unifié. Un cabaliste demande pourquoi. Un cabaliste croit qu'il a la responsabilité de faire du monde un meilleur endroit. ''
Le gouvernement israélien a saisi la visite du chanteur pour la promotion du tourisme,contrefaçon rolex datejust lady 31, et le ministre du Tourisme, Gideon Ezra, lui a présenté une lampe à huile d'époque byzantine et une pièce de monnaie le dimanche. Plus tôt,rolex datejust oyster perpetual replique, il avait suggéré qu'il serait utile si Madonna poserait pour une photo avec Prime Le ministre Ariel Sharon, bien qu'il n'y ait aucun signe que cela se soit concrétisé.
Madonna est arrivée mercredi soir, au début de Rosh Hashana, le Nouvel An juif, et les organisateurs ont annoncé des visites planifiées à plusieurs sanctuaires religieux. Mais chaque fois qu'elle essayait de s'aventurer, elle se trouvait entourée.
Après le dîner de vendredi soir à Tel-Aviv, deux de ses gardes du corps ont été arrêtés après s'être égarés et avoir blessé deux photographes.
Juste après minuit samedi, elle a fait un pèlerinage à la tombe de Jérusalem du sage de cabaliste Rabbi Yehuda Ashlag.
Madonna et son mari, avec la police et les photographes à la remorque, ont passé plus d'une heure à l'intérieur du mausolée en pierre. Elle a prié, a chanté et a placé des bougies sur le tombeau, et peu de temps avant de quitter les larmes effacées de ses yeux. Par la suite, elle a fait son voyage abrégé vers le mur occidental, le site le plus saint pour la prière juive. D'autres visites prévues, y compris un voyage à la tombe de la matriarche biblique Rachel, qui se trouve dans la ville palestinienne de Bethléem en Cisjordanie, n'ont jamais eu lieu.
Alors que Madonna a étudié la cabala pendant sept ans, il y a encore beaucoup de sceptiques qui s'interrogent sur son engagement envers une forme d'étude traditionnellement réservée aux hommes de plus de 40 ans qui maîtrisent la Torah et le Talmud. 'Il est interdit d'enseigner une cabane non juive', 'Yitzhak Kadouri, un cabaliste de premier plan, a déclaré au journal israélien Maariv. Mais le Centre de Kabbalah dit que la cabale est ouverte à tous.
Madonna voulait voir Israël et les Israéliens avaient envie de voir Madonna. Mais à la fin, chacun n'a réussi à apercevoir l'autre. Elle est venue avec quelque 2 000 camarades de cabala, une forme de mysticisme juif,contrefaçon rolex datejust fond bleu, et a passé la plupart de ses cinq jours ici dans l'hôtel David Inter Continental, en face de la plage. Un grand nombre d'adorateurs participaient à des prières liées à la nouvelle année juive,rolex oyster perpetual datejust femme contrefaçon, qui est tombée la semaine dernière. Plusieurs dizaines de photographes rôdaient les terrains. Madonna regarda les fenêtres sombres de sa camionnette pendant plusieurs minutes alors que la foule se rassemblait. La camionnette a ensuite chassé sans Madonna en ouvrant la porte.
Les Israéliens séculiers ont été affamés pour de grands noms d'actes internationaux ces dernières années et étaient prêts à embrasser Madonna, qui a chanté ici en 1993. Mais elle est venu prier pour ne pas jouer. Elle et son mari, le cinéaste britannique Guy Ritchie, ont participé à des séances de cabales dans la salle de conférence de l'hôtel, qui a été transformée en synagogue, avec des sections séparées d'hommes et de femmes.
La seule apparition publique officielle de Madonna est venue dimanche soir, lorsque le centre de Kabbalah basé à Los Angeles, qui a organisé le voyage, a organisé un programme pour enfants à l'hôtel qui présentait des jeunes juifs et arabes et a attiré plus de 1 000 invités, dont le gouvernement israélien Les officiels.
J'étais un peu hésitant à venir ici après avoir vu tant de nouvelles sur les attaques terroristes ', a déclaré Madonna, portant une robe découpée avec un imprimé léopard noir et blanc. Je me rends compte maintenant qu'il n'est plus dangereux d'être ici que de l'être à New York. ''
Madonna explore la cabala depuis 1997 et s'habille maintenant et joue souvent avec des symboles du judaïsme et de la cabale. Elle porte parfois une étoile de David et a souvent un fil rouge sur son poignet, une marque de commerce de cabala destinée à écarter le mauvais œil. Quand elle a visité un restaurant de Tel Aviv, elle portait un collier brillant avec une grande lettre E, apparemment une référence à sa récente adaptation du nom juif biblique Esther.
Mais Madonna a dit qu'elle ne représentait pas une religion. Je suis ici en tant qu'étudiant de cabala ', at-elle dit.' Un cabaliste voit le monde comme un tout unifié. Un cabaliste demande pourquoi. Un cabaliste croit qu'il a la responsabilité de faire du monde un meilleur endroit. ''
Le gouvernement israélien a saisi la visite du chanteur pour la promotion du tourisme,contrefaçon rolex datejust lady 31, et le ministre du Tourisme, Gideon Ezra, lui a présenté une lampe à huile d'époque byzantine et une pièce de monnaie le dimanche. Plus tôt,rolex datejust oyster perpetual replique, il avait suggéré qu'il serait utile si Madonna poserait pour une photo avec Prime Le ministre Ariel Sharon, bien qu'il n'y ait aucun signe que cela se soit concrétisé.
Madonna est arrivée mercredi soir, au début de Rosh Hashana, le Nouvel An juif, et les organisateurs ont annoncé des visites planifiées à plusieurs sanctuaires religieux. Mais chaque fois qu'elle essayait de s'aventurer, elle se trouvait entourée.
Après le dîner de vendredi soir à Tel-Aviv, deux de ses gardes du corps ont été arrêtés après s'être égarés et avoir blessé deux photographes.
Juste après minuit samedi, elle a fait un pèlerinage à la tombe de Jérusalem du sage de cabaliste Rabbi Yehuda Ashlag.
Madonna et son mari, avec la police et les photographes à la remorque, ont passé plus d'une heure à l'intérieur du mausolée en pierre. Elle a prié, a chanté et a placé des bougies sur le tombeau, et peu de temps avant de quitter les larmes effacées de ses yeux. Par la suite, elle a fait son voyage abrégé vers le mur occidental, le site le plus saint pour la prière juive. D'autres visites prévues, y compris un voyage à la tombe de la matriarche biblique Rachel, qui se trouve dans la ville palestinienne de Bethléem en Cisjordanie, n'ont jamais eu lieu.
Alors que Madonna a étudié la cabala pendant sept ans, il y a encore beaucoup de sceptiques qui s'interrogent sur son engagement envers une forme d'étude traditionnellement réservée aux hommes de plus de 40 ans qui maîtrisent la Torah et le Talmud. 'Il est interdit d'enseigner une cabane non juive', 'Yitzhak Kadouri, un cabaliste de premier plan, a déclaré au journal israélien Maariv. Mais le Centre de Kabbalah dit que la cabale est ouverte à tous.
Le voleur de banque de Lakewood a attrapé après avoir quitté les clés de voiture à la scène,contrefaçon rolex oyster perpetual datejust lady 31
Au fur et à mesure que les officiers se rendent à la banque, les répartiteurs ont eu une description de l'appelant d'un homme portant des lunettes, un pull-over gris et une casquette de base-ball noir de police de l'état du New Jersey, a déclaré Staffordsmith.
Les officiers ont ensuite déterminé que le suspect du vol qualifié avait pris environ 2 000 $ de la banque mais avait laissé ses clés de voiture sur les lieux, a ajouté Staffordsmith. Lorsque l'officier s'est approché de l'homme et s'est identifié lui-même,rolex datejust 2 fond bleu contrefaçon, Van Arsdale aurait jeté une grande somme de liquidités et de certains effets personnels et s'est enfui.
Quelques deux blocs plus tard, trois officiers ont appréhendé le suspect,rolex datejust femme faux, a déclaré Staffordsmith.
Le FBI a assisté à l'enquête et Van Arsdale a été accusé de vol de premier degré pour le vol à la banque de Lakewood et un autre vol de premier degré compte pour un vol à une Banque TD à Lakewood le 22 février.
Le cautionnement pour le vol du mardi a été fixé à 80 000 $ sans option de trésorerie de 10% et 50 000 $ supplémentaires sans option de trésorerie de 10% pour le vol de février,rolex datejust contrefaçon.
Au fur et à mesure que les officiers se rendent à la banque, les répartiteurs ont eu une description de l'appelant d'un homme portant des lunettes, un pull-over gris et une casquette de base-ball noir de police de l'état du New Jersey, a déclaré Staffordsmith.
Les officiers ont ensuite déterminé que le suspect du vol qualifié avait pris environ 2 000 $ de la banque mais avait laissé ses clés de voiture sur les lieux, a ajouté Staffordsmith. Lorsque l'officier s'est approché de l'homme et s'est identifié lui-même,rolex datejust 2 fond bleu contrefaçon, Van Arsdale aurait jeté une grande somme de liquidités et de certains effets personnels et s'est enfui.
Quelques deux blocs plus tard, trois officiers ont appréhendé le suspect,rolex datejust femme faux, a déclaré Staffordsmith.
Le FBI a assisté à l'enquête et Van Arsdale a été accusé de vol de premier degré pour le vol à la banque de Lakewood et un autre vol de premier degré compte pour un vol à une Banque TD à Lakewood le 22 février.
Le cautionnement pour le vol du mardi a été fixé à 80 000 $ sans option de trésorerie de 10% et 50 000 $ supplémentaires sans option de trésorerie de 10% pour le vol de février,rolex datejust contrefaçon.
Conseiller en placement manquant pour 528 jours se retourne à la police
SubscriptionsGo au Centre d'abonnements pour gérer votre: My Profile. Sa disparition a déclenché une recherche frénétique sur l'île de Vancouver et dans l'état de Washington après que les images de surveillance aient montré une description de Backer du cycliste à partir du ferry de Coho à Port Angeles, Washington. A été blessé ou perdu, mais la recherche a pris un ton différent lorsque les clients de l'investissement,rolex submariner occasion suisse replique, y compris plusieurs amis proches et le frère de Backer, ont reçu des lettres du conseiller expliquant qu'il avait perdu ses investissements. Les images de Harold Backer après le transport du ferry de Coho à Washington Le 3 novembre 2015. Il est confronté à deux chefs d'accusation de fraude de plus de 5 000 $ avec une audience prévue pour mardi. Les fonctionnaires ont déclaré à CBC News qu'il n'est pas clair pourquoi Backer s'est tourné vers lui et que les fonctionnaires enquêtent toujours sur l'endroit où il est Été depuis novembre 2015. Dans une déclaration écrite,rolex submariner replique, le ministère a déclaré que les enquêteurs sur le crime financier ont commencé à examiner My Financial Backer Corporation et Back Il s'était éloigné peu de temps après que le conseiller ait disparu.Carr a découvert que Backer avait disparu peu de temps après l'observation du ferry. 'Un autre autocar à rames m'a téléphoné et m'a dit:' Savez-vous les disparus de Harold? 'Et dès que j'ai entendu cela,rolex submariner oyster perpetual date replique, je pensais, 'De même mon argent', 'l'entraîneur a déclaré à The Fifth Estate de CBC dans un documentaire diffusé plus tôt cette année. Backer a continué d'entraîner l'aviron après sa retraite en tant qu'athlète professionnelle. (Trouver Harold Backer / Facebook) CBC News a attiré les Carrs pour avoir commenté l'arrestation de Backer, mais ils ne se sont pas mis à la disposition des médias. Luke Mills, qui a commencé une page Facebook pour diffuser le mot sur la disparition de Backer En 2015,contrefaçon nouvelle rolex submariner, a déclaré qu'il était 'choqué' quand il a entendu Backer se livrer.
SubscriptionsGo au Centre d'abonnements pour gérer votre: My Profile. Sa disparition a déclenché une recherche frénétique sur l'île de Vancouver et dans l'état de Washington après que les images de surveillance aient montré une description de Backer du cycliste à partir du ferry de Coho à Port Angeles, Washington. A été blessé ou perdu, mais la recherche a pris un ton différent lorsque les clients de l'investissement,rolex submariner occasion suisse replique, y compris plusieurs amis proches et le frère de Backer, ont reçu des lettres du conseiller expliquant qu'il avait perdu ses investissements. Les images de Harold Backer après le transport du ferry de Coho à Washington Le 3 novembre 2015. Il est confronté à deux chefs d'accusation de fraude de plus de 5 000 $ avec une audience prévue pour mardi. Les fonctionnaires ont déclaré à CBC News qu'il n'est pas clair pourquoi Backer s'est tourné vers lui et que les fonctionnaires enquêtent toujours sur l'endroit où il est Été depuis novembre 2015. Dans une déclaration écrite,rolex submariner replique, le ministère a déclaré que les enquêteurs sur le crime financier ont commencé à examiner My Financial Backer Corporation et Back Il s'était éloigné peu de temps après que le conseiller ait disparu.Carr a découvert que Backer avait disparu peu de temps après l'observation du ferry. 'Un autre autocar à rames m'a téléphoné et m'a dit:' Savez-vous les disparus de Harold? 'Et dès que j'ai entendu cela,rolex submariner oyster perpetual date replique, je pensais, 'De même mon argent', 'l'entraîneur a déclaré à The Fifth Estate de CBC dans un documentaire diffusé plus tôt cette année. Backer a continué d'entraîner l'aviron après sa retraite en tant qu'athlète professionnelle. (Trouver Harold Backer / Facebook) CBC News a attiré les Carrs pour avoir commenté l'arrestation de Backer, mais ils ne se sont pas mis à la disposition des médias. Luke Mills, qui a commencé une page Facebook pour diffuser le mot sur la disparition de Backer En 2015,contrefaçon nouvelle rolex submariner, a déclaré qu'il était 'choqué' quand il a entendu Backer se livrer.
Le dernier CD du tromboniste de jazz le mélange
Nick La Riviere est apparu comme puriste du jazz à la suite d'études musicales au Capilano College. À l'époque, il écoutait uniquement le jazz. Il n'a écrit que des compositions de jazz. Il n'a transcrit que des solos de jazz.
Maintenant, le tromboniste de 31 ans a élargi ses horizons musicaux. Alors que son premier album de 2009 Too Much to Do était un disque de jazz, l'effort de deuxième année de La Rivière, Another Time Around, couvre le front de mer. Ses chansons autodidacées (dont il débutera à la sortie de deux CD montrent ce week-end) embrassent Gospel, Ska, pop, rock, afro pop, funk et plus encore.
La Rivière compte Ben Folds,contrefaçon cadran rolex submariner, Sam Cooke et Paul Simon parmi ses influences. 'Je ne veux pas être enfermé dans un seul genre', at-il dit. 'Je préfère me considérer comme un musicien plutôt que comme un musicien de jazz'.
La nécessité était la mère de la diversification musicale. La Rivière a commencé à élargir son champ d'application au début de sa carrière, alors qu'un concert de croisière de trois ans exigeait des compétences dans tous les genres. Plus tard, pour survivre en tant que musicien à plein temps à Victoria, il a travaillé encore plus fort pour devenir un Jack de tous styles.
De nos jours, en dirigeant un groupe sous son propre nom, La Riviere joue avec The Hifi (New York style funk), Locarno (Latin), Southern Urge (rock) et The Riverside (rock classique avec les membres de The Grapes of Wrath et 54,40). Il y a même des concerts occasionnels avec un groupe klezmer.
Contrairement au disque instrumental Too Much to Do, La Riviere chante sur le nouvel album. Cela a commencé il y a quelques années, lorsque son combo de jazz a commencé à couvrir les chansons du Dr John et Jamiroquai. La Rivière, qui a chanté avec le chœur de Bach de Vancouver en tant que petit, a commencé à sortir comme chanteuse.
Comme pour démontrer davantage son large éventail de compétences, cette semaine,rolex submariner or acier occasion replique, le tromboniste a sorti une coquille lors d'un tirage au journal. La Rivière a commencé à jouer à des conches (elles produisent une corne comme son) il y a dix ans. Il a même un étui spécial en mousse pour ses coquilles afin de ne pas être endommagé en transit.
La polyvalence de La Rivière est représentée sur la couverture lenticulaire d'Another Time Around (l'effet multi pose est similaire à l'album art sur les Rolling Stones 'The Satanic Majesties Request'). Cela montre à La Riviere le trombone, la conque et le chant.
Il a également un autre coup dans sa manche: il joue de la basse sur plusieurs pistes.
Dans la version de démonstration de son disque enregistré à la maison, La Rivière a joué tous les instruments à l'exception de la batterie: trombone, basse, guitare et piano. Certains d'entre eux étaient des pistes de guidage, finalement remplacés par des contributions de ces musiciens. Comme Michael Kaeshammer, Alpha Yaya Diallo et Aidan Miller. L'album a ensuite été mélangé et maîtrisé par Joby Baker.
La Riviere admet que sa prouesse instrumentale peut être un sac mélangé. Par exemple, alors qu'il est un bassiste solide (il a joué de la basse avec The Paperboys), ses compétences de guitare sont primitifs. 'Je suis un guitariste horrible, alors dans les quelques cas où il y avait de la guitare,contrefaçon rolex submariner bleu, je l'ai enregistré une ficelle à la fois pour la démo, même les accords'.
La Rivière a enregistré des pistes de lit dans son appartement au sous-sol à l'aide du logiciel Apple Logic. Pour les contributions des invités, il a emballé son équipement d'enregistrement et a visité chaque musicien. Le guitariste natif guinéen Alpha Yaya Diallo, qui vit à Vancouver, a envoyé son offre par ordinateur.
Il n'y a qu'une seule chanson commune qui écrive du crédit sur Another Time Around. Les paroles de Woohoo, une chanson pop rock exubérante, ont été écrites par Geoffrey Kelly de Spirit of the West.
La collaboration s'est produite lorsque La Rivière et Kelly furent en tournée avec The Paperboys. Ils ont été chargés de transporter la fourgonnette du groupe d'Angleterre à Amsterdam. Sur le ferry, la paire a rêvé des mots à Woohoo.
Au club de jazz de Hermann, La Riviere sera rejointe par le claviériste Miller, le guitariste Kelly Fawcett, le batteur Damian Graham et le bassiste Sean Drabitt ainsi que les chanteurs invités.
Il peut même retirer ces coquilles de conque mais seulement pour une seule mélodie. 'Vous ne pouvez faire que beaucoup avec eux',rolex submariner black replique.
Nick La Riviere est apparu comme puriste du jazz à la suite d'études musicales au Capilano College. À l'époque, il écoutait uniquement le jazz. Il n'a écrit que des compositions de jazz. Il n'a transcrit que des solos de jazz.
Maintenant, le tromboniste de 31 ans a élargi ses horizons musicaux. Alors que son premier album de 2009 Too Much to Do était un disque de jazz, l'effort de deuxième année de La Rivière, Another Time Around, couvre le front de mer. Ses chansons autodidacées (dont il débutera à la sortie de deux CD montrent ce week-end) embrassent Gospel, Ska, pop, rock, afro pop, funk et plus encore.
La Rivière compte Ben Folds,contrefaçon cadran rolex submariner, Sam Cooke et Paul Simon parmi ses influences. 'Je ne veux pas être enfermé dans un seul genre', at-il dit. 'Je préfère me considérer comme un musicien plutôt que comme un musicien de jazz'.
La nécessité était la mère de la diversification musicale. La Rivière a commencé à élargir son champ d'application au début de sa carrière, alors qu'un concert de croisière de trois ans exigeait des compétences dans tous les genres. Plus tard, pour survivre en tant que musicien à plein temps à Victoria, il a travaillé encore plus fort pour devenir un Jack de tous styles.
De nos jours, en dirigeant un groupe sous son propre nom, La Riviere joue avec The Hifi (New York style funk), Locarno (Latin), Southern Urge (rock) et The Riverside (rock classique avec les membres de The Grapes of Wrath et 54,40). Il y a même des concerts occasionnels avec un groupe klezmer.
Contrairement au disque instrumental Too Much to Do, La Riviere chante sur le nouvel album. Cela a commencé il y a quelques années, lorsque son combo de jazz a commencé à couvrir les chansons du Dr John et Jamiroquai. La Rivière, qui a chanté avec le chœur de Bach de Vancouver en tant que petit, a commencé à sortir comme chanteuse.
Comme pour démontrer davantage son large éventail de compétences, cette semaine,rolex submariner or acier occasion replique, le tromboniste a sorti une coquille lors d'un tirage au journal. La Rivière a commencé à jouer à des conches (elles produisent une corne comme son) il y a dix ans. Il a même un étui spécial en mousse pour ses coquilles afin de ne pas être endommagé en transit.
La polyvalence de La Rivière est représentée sur la couverture lenticulaire d'Another Time Around (l'effet multi pose est similaire à l'album art sur les Rolling Stones 'The Satanic Majesties Request'). Cela montre à La Riviere le trombone, la conque et le chant.
Il a également un autre coup dans sa manche: il joue de la basse sur plusieurs pistes.
Dans la version de démonstration de son disque enregistré à la maison, La Rivière a joué tous les instruments à l'exception de la batterie: trombone, basse, guitare et piano. Certains d'entre eux étaient des pistes de guidage, finalement remplacés par des contributions de ces musiciens. Comme Michael Kaeshammer, Alpha Yaya Diallo et Aidan Miller. L'album a ensuite été mélangé et maîtrisé par Joby Baker.
La Riviere admet que sa prouesse instrumentale peut être un sac mélangé. Par exemple, alors qu'il est un bassiste solide (il a joué de la basse avec The Paperboys), ses compétences de guitare sont primitifs. 'Je suis un guitariste horrible, alors dans les quelques cas où il y avait de la guitare,contrefaçon rolex submariner bleu, je l'ai enregistré une ficelle à la fois pour la démo, même les accords'.
La Rivière a enregistré des pistes de lit dans son appartement au sous-sol à l'aide du logiciel Apple Logic. Pour les contributions des invités, il a emballé son équipement d'enregistrement et a visité chaque musicien. Le guitariste natif guinéen Alpha Yaya Diallo, qui vit à Vancouver, a envoyé son offre par ordinateur.
Il n'y a qu'une seule chanson commune qui écrive du crédit sur Another Time Around. Les paroles de Woohoo, une chanson pop rock exubérante, ont été écrites par Geoffrey Kelly de Spirit of the West.
La collaboration s'est produite lorsque La Rivière et Kelly furent en tournée avec The Paperboys. Ils ont été chargés de transporter la fourgonnette du groupe d'Angleterre à Amsterdam. Sur le ferry, la paire a rêvé des mots à Woohoo.
Au club de jazz de Hermann, La Riviere sera rejointe par le claviériste Miller, le guitariste Kelly Fawcett, le batteur Damian Graham et le bassiste Sean Drabitt ainsi que les chanteurs invités.
Il peut même retirer ces coquilles de conque mais seulement pour une seule mélodie. 'Vous ne pouvez faire que beaucoup avec eux',rolex submariner black replique.
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus plantarum est une bactérie Gram positive, qui fait fermenter les plantes et est utilisée industriellement pour fabriquer du yogourt, du fromage et des légumes décapés. Outre les plantes, L. plantarum se trouve dans le tractus gastro-intestinal humain et agit comme une bactérie probiotique. Sa capacité à survivre dans le tractus GI a fait de cette bactérie une cible pour de nouvelles recherches pour l'utiliser comme véhicule pour délivrer des vaccins recombinants et des traitements contre les maladies. [1] En 2003, Michiel Kleerebezem a tracé le génome complet de Lactobacillus plantarum WCFS1. La souche WCFS1 de Lactobacillus plantarum est connue pour avoir 3 308 274 paires de bases et contient 3 052 gènes codant pour la protéine ainsi que trois plasmides (1 917 pb, 2,365 pb et 36 069 pb), ce qui explique sa grande adaptabilité. La teneur en G + C du chromosome est de 44,5%, mais les plasmides contiennent un peu moins de C + C. [1] Structure cellulaire et métabolismeLactobacillus plantarum est une bactérie hautement adaptable qui peut survivre à des températures comprises entre 1 et 60 degrés Celsius et aussi une très bonne pression atmosphérique. Le nom 'plantarum' indique que cette bactérie est une 'espèce des plantes'. L. plantarum se trouve en particulier dans les plantes fermentées, telles que kimchee. Cependant, il se retrouve également dans d'autres aliments fermentés tels que le yogourt et le fromage et il se trouve également dans les tractus animaux GI, la salive humaine et le vagin. [3] [4] [1] Lactobacillus plantarum 299v est réellement considéré comme un probiotique. En raison de sa capacité à survivre dans le tractus GI humain pendant> 6 jours, L. plantarum 299v peut inhiber la croissance d'autres bactéries nocives telles que E. coli dans l'hôte après consommation de viande contaminée. L. plantarum 299v se trouve dans divers aliments fermentés tels que le yogourt,contrefaçon rolex submariner pas cher, le fromage, le kimchee, et il est recommandé de consommer régulièrement pour soutenir le système immunitaire. En outre, la capacité de L. plantarum 299v à produire de l'acide lactique aide à maintenir des niveaux de pH sains et faibles du tractus GI. [1] [3] [4] En 2004, Jean Marie Perrier Cornet a découvert un moyen de contrôler la fermentation alimentaire en utilisant Lactobacillus plantarum, une bactérie alimentaire commune avec une résistance à une bonne gamme de température, de pression et de pH. Une méthode de pasteurisation froide sans congélation de la nourriture et donc la modification de la composition de l'aliment est une nouvelle technologie d'intérêt pour l'industrie alimentaire. Perrier Cornet a trouvé une optimisation de la procédure lors de la pasteurisation de L. plantarum pendant 10 min à des températures comprises entre 20 et 25 ° C et une pression entre 100 et 350 MPa. [5] En 2006, Michael Schultz a étudié les effets du traitement avec Lactobacillus plantarum 299v sur des souris immunodéficientes sujettes au développement de la colite. L'étude a révélé que L. plantarum 299v administré par voie orale avec de l'eau à des souris déficientes en interleukine 10 a produit des résultats significatifs de réduction de la colite immunitaire médiée. Cela suggère que L. plantarum 299v a le potentiel d'être utilisé contre la maladie inflammatoire intestinale clinique. [6] En 2008, Beatriz del Rio a étudié l'utilisation de Lactobacillus plantarum recombinant vivant en tant que véhicule de livraison orale pour un vaccin contre la maladie de Lyme pour invoquer une réponse immunitaire protectrice chez la souris. Parce que L. plantarum peut survivre dans le tractus GI, il a longtemps été pris en compte pour ce type de recherche. L. plantarum a exprimé avec succès des antigènes vaccinaux induisant une immunité chez les souris infectées par la maladie de Lyme. [7] En 2009, Alistair W. G. Waugh a étudié les effets du traitement avec Lactobacillus plantarum 299v sur des souris saines induites par un syndrome du côlon irritable par administration rectale de 1% d'isothiocyanate d'allyle dans 30% d'éthanol. Les souris ont ensuite été nourries par la force L. plantarum 299v pendant 28 jours. Les résultats ont montré que L. plantarum 299v a réduit l'inflammation et normalisé les intestins. [8] 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 Kleerebezem, Michiel, Jos Boekhorst, Richard van Kranenburg, Douwe Molenaar, Oscar P. Kuipers, Rob Leer, Renato Tarchini, Sander A. Peters, Hans M. Sandbrink, Mark WEJ Fiers, Willem Stiekema, Ren M. Klein Lankhorst,rolex submariner rouge replique, Peter A. Bron, Sally M. Hoffer, Masja N. Nierop Groot, Robert Kerkhoven, Maaike de Vries, Bjrn Ursing, Willem M. de Vos et Roland J. Siezen. (2003). [1] Séquence complète du génome de Lactobacillus plantarum WCFS1. Actes de l'Académie nationale des sciences, 100 (4), 1990 1995. 'Lactobacillus'. MicrobeWiki. 8 avril 2009 Kenyon College. 21 avril 2009. [2] 3.0 3.1 'Bacteria Genomes LACTOBACILLUS PLANTARUM' Institut européen de bioinformatique. Laboratoire Européen de Biologie Moléculaire. 21 avril 2009. [3] Beatriz del Rio, Raymond J. Dattwyler, Miguel Aroso,boite rolex submariner replique, Vera Neves, Luciana Meirelles, Jos F. M. L. Seegers et Maria Gomes Solecki1. (2008) [7] L'immunisation par voie orale avec le Lactobacillus plantarum recombinant induit une réponse immunitaire protectrice chez les souris atteintes de la maladie de Lyme. Inmunologie clinique et en vaccins,contrefaçon rolex submariner neuf, 15. (9), 1429 1435 Waugh, Alistair W. G., Rae Foshaug, Sarah Macfarlane, Jason SG Doyle, Thomas A. Churchill, Beate C. Sydora, Richard N. Fedorak. (2009). [8] Effet du traitement Lactobacillus plantarum 299v dans un modèle animal du syndrome du côlon irritable. Microbienne en santé et maladie, 21. (1), 33 37.
Lactobacillus plantarum est une bactérie Gram positive, qui fait fermenter les plantes et est utilisée industriellement pour fabriquer du yogourt, du fromage et des légumes décapés. Outre les plantes, L. plantarum se trouve dans le tractus gastro-intestinal humain et agit comme une bactérie probiotique. Sa capacité à survivre dans le tractus GI a fait de cette bactérie une cible pour de nouvelles recherches pour l'utiliser comme véhicule pour délivrer des vaccins recombinants et des traitements contre les maladies. [1] En 2003, Michiel Kleerebezem a tracé le génome complet de Lactobacillus plantarum WCFS1. La souche WCFS1 de Lactobacillus plantarum est connue pour avoir 3 308 274 paires de bases et contient 3 052 gènes codant pour la protéine ainsi que trois plasmides (1 917 pb, 2,365 pb et 36 069 pb), ce qui explique sa grande adaptabilité. La teneur en G + C du chromosome est de 44,5%, mais les plasmides contiennent un peu moins de C + C. [1] Structure cellulaire et métabolismeLactobacillus plantarum est une bactérie hautement adaptable qui peut survivre à des températures comprises entre 1 et 60 degrés Celsius et aussi une très bonne pression atmosphérique. Le nom 'plantarum' indique que cette bactérie est une 'espèce des plantes'. L. plantarum se trouve en particulier dans les plantes fermentées, telles que kimchee. Cependant, il se retrouve également dans d'autres aliments fermentés tels que le yogourt et le fromage et il se trouve également dans les tractus animaux GI, la salive humaine et le vagin. [3] [4] [1] Lactobacillus plantarum 299v est réellement considéré comme un probiotique. En raison de sa capacité à survivre dans le tractus GI humain pendant> 6 jours, L. plantarum 299v peut inhiber la croissance d'autres bactéries nocives telles que E. coli dans l'hôte après consommation de viande contaminée. L. plantarum 299v se trouve dans divers aliments fermentés tels que le yogourt,contrefaçon rolex submariner pas cher, le fromage, le kimchee, et il est recommandé de consommer régulièrement pour soutenir le système immunitaire. En outre, la capacité de L. plantarum 299v à produire de l'acide lactique aide à maintenir des niveaux de pH sains et faibles du tractus GI. [1] [3] [4] En 2004, Jean Marie Perrier Cornet a découvert un moyen de contrôler la fermentation alimentaire en utilisant Lactobacillus plantarum, une bactérie alimentaire commune avec une résistance à une bonne gamme de température, de pression et de pH. Une méthode de pasteurisation froide sans congélation de la nourriture et donc la modification de la composition de l'aliment est une nouvelle technologie d'intérêt pour l'industrie alimentaire. Perrier Cornet a trouvé une optimisation de la procédure lors de la pasteurisation de L. plantarum pendant 10 min à des températures comprises entre 20 et 25 ° C et une pression entre 100 et 350 MPa. [5] En 2006, Michael Schultz a étudié les effets du traitement avec Lactobacillus plantarum 299v sur des souris immunodéficientes sujettes au développement de la colite. L'étude a révélé que L. plantarum 299v administré par voie orale avec de l'eau à des souris déficientes en interleukine 10 a produit des résultats significatifs de réduction de la colite immunitaire médiée. Cela suggère que L. plantarum 299v a le potentiel d'être utilisé contre la maladie inflammatoire intestinale clinique. [6] En 2008, Beatriz del Rio a étudié l'utilisation de Lactobacillus plantarum recombinant vivant en tant que véhicule de livraison orale pour un vaccin contre la maladie de Lyme pour invoquer une réponse immunitaire protectrice chez la souris. Parce que L. plantarum peut survivre dans le tractus GI, il a longtemps été pris en compte pour ce type de recherche. L. plantarum a exprimé avec succès des antigènes vaccinaux induisant une immunité chez les souris infectées par la maladie de Lyme. [7] En 2009, Alistair W. G. Waugh a étudié les effets du traitement avec Lactobacillus plantarum 299v sur des souris saines induites par un syndrome du côlon irritable par administration rectale de 1% d'isothiocyanate d'allyle dans 30% d'éthanol. Les souris ont ensuite été nourries par la force L. plantarum 299v pendant 28 jours. Les résultats ont montré que L. plantarum 299v a réduit l'inflammation et normalisé les intestins. [8] 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 Kleerebezem, Michiel, Jos Boekhorst, Richard van Kranenburg, Douwe Molenaar, Oscar P. Kuipers, Rob Leer, Renato Tarchini, Sander A. Peters, Hans M. Sandbrink, Mark WEJ Fiers, Willem Stiekema, Ren M. Klein Lankhorst,rolex submariner rouge replique, Peter A. Bron, Sally M. Hoffer, Masja N. Nierop Groot, Robert Kerkhoven, Maaike de Vries, Bjrn Ursing, Willem M. de Vos et Roland J. Siezen. (2003). [1] Séquence complète du génome de Lactobacillus plantarum WCFS1. Actes de l'Académie nationale des sciences, 100 (4), 1990 1995. 'Lactobacillus'. MicrobeWiki. 8 avril 2009 Kenyon College. 21 avril 2009. [2] 3.0 3.1 'Bacteria Genomes LACTOBACILLUS PLANTARUM' Institut européen de bioinformatique. Laboratoire Européen de Biologie Moléculaire. 21 avril 2009. [3] Beatriz del Rio, Raymond J. Dattwyler, Miguel Aroso,boite rolex submariner replique, Vera Neves, Luciana Meirelles, Jos F. M. L. Seegers et Maria Gomes Solecki1. (2008) [7] L'immunisation par voie orale avec le Lactobacillus plantarum recombinant induit une réponse immunitaire protectrice chez les souris atteintes de la maladie de Lyme. Inmunologie clinique et en vaccins,contrefaçon rolex submariner neuf, 15. (9), 1429 1435 Waugh, Alistair W. G., Rae Foshaug, Sarah Macfarlane, Jason SG Doyle, Thomas A. Churchill, Beate C. Sydora, Richard N. Fedorak. (2009). [8] Effet du traitement Lactobacillus plantarum 299v dans un modèle animal du syndrome du côlon irritable. Microbienne en santé et maladie, 21. (1), 33 37.
Les inondations créent l'état d'urgence à Courtenay
D'autres tempêtes de pluie et de vent devraient toucher l'île de Vancouver mercredi et jeudi contre les tempêtes qui ont causé des inondations, des pannes de courant et des arbres abattus.
Alors que la Grande Victoria a esquivé le pire des temps,contrefaçon montre rolex submariner date, la vallée de Comox et la vallée de Alberni ont été martelées lundi et mardi.
Les inondations à Courtenay ont amené le maire Larry Jangula à déclarer l'état d'urgence. La ville a fermé les rues et les sentiers dans les zones basses, ainsi que les installations récréatives de Lewis Park. Mardi, 82 mm sont tombés. Avec jusqu'à 70 mm de plus de prévisions pour aujourd'hui, Courtenay se prépare à empirer les inondations. Hydro a déclaré que le risque d'inondation se poursuivra jusqu'à jeudi. Les inondations pourraient éclipser les inondations dévastatrices qui se sont produites en 2009 et 2010,rolex submariner occasion paris replique, a déclaré un porte-parole de la Courtenay.
De Fanny Bay à Courtenay,contrefaçon occasion rolex submariner, certaines parties de la route intérieure sont devenues dangereuses en raison de la mise en commun de l'eau. Les inondations ont forcé la fermeture du pont de la rue Fifth Street de Courtenay, avec une circulation s'étendant sur deux kilomètres.
À Port Alberni, les résidents ont signalé des inondations dans des sous-sols et des milliers de pertes de pouvoir. Les équipages municipaux ont bloqué la troisième et la quatrième avenue inférieures, où les propriétaires d'entreprises inondés se sont précipités pour faire face à l'eau de pluie qui se dégageait alors que les égouts pluviaux débordaient. Le vent a déchiré le toit des ventes automobiles de Tar sur Third Avenue et les eaux pluviales ont forcé le personnel à évacuer.
Le service d'incendie de Port Alberni, le capitaine Herb Nadig, a déclaré: 'Beaucoup d'arbres vers le bas, des arbres sur les lignes électriques'. Les pompiers ont cordonné les zones où les lignes électriques étaient en panne et leur disaient aux résidents de rester à l'intérieur. Hydro a déclaré que le vent avait éliminé le pouvoir à environ 11 000 clients dans l'île du Nord et près de 4 000 dans l'île du Sud. Le mardi soir,cadran rolex submariner replique, le pouvoir était de retour pour la plupart des clients de l'île du Sud, mais des centaines étaient encore sans électricité plus au nord. Hydro. Le vent a frappé des arbres sur des lignes électriques et a causé beaucoup à la chute, at-elle dit. Les équipages hydroélectriques en les forçant à prendre des détours pour arriver à des endroits difficiles, a déclaré Louwers. Mardi matin, Maryann Rumney a sauté du lit après avoir entendu ce qui ressemblait à des meubles qui grattaient le sol de sa maison de Port Alberni. Il s'est avéré être un arbre qui tombe sur la vieille maison en arbre de son fils. 'Nous avons vécu ici 28 ans et j'avais toujours peur qu'il ne descendît', a déclaré Rumney.
La famille a abandonné les plans pour abattre la maison de l'arbre, qui n'est plus utilisée par le fils adulte de Rumney, Aaron. 'C'est un peu triste parce que [le mari de Rumney] Ross et Aaron l'ont construit quand Aaron avait six ans , Dit-elle. Dès que je suis entré dans la porte, je pouvais sentir l'humidité et trouver quatre pouces d'eau dans le sous-sol.
La Grande Victoria s'est échappée relativement indemne.
La pluie continuera aujourd'hui dans la Grande Victoria avec une attente de 25 à 35 mm, surtout entre minuit et midi, a déclaré Doug Lundquist, météorologue d'Environnement Canada. 'Une troisième tempête pourrait rouler jeudi. Mais vendredi, l'ensemble du système prend son envol'.
D'autres tempêtes de pluie et de vent devraient toucher l'île de Vancouver mercredi et jeudi contre les tempêtes qui ont causé des inondations, des pannes de courant et des arbres abattus.
Alors que la Grande Victoria a esquivé le pire des temps,contrefaçon montre rolex submariner date, la vallée de Comox et la vallée de Alberni ont été martelées lundi et mardi.
Les inondations à Courtenay ont amené le maire Larry Jangula à déclarer l'état d'urgence. La ville a fermé les rues et les sentiers dans les zones basses, ainsi que les installations récréatives de Lewis Park. Mardi, 82 mm sont tombés. Avec jusqu'à 70 mm de plus de prévisions pour aujourd'hui, Courtenay se prépare à empirer les inondations. Hydro a déclaré que le risque d'inondation se poursuivra jusqu'à jeudi. Les inondations pourraient éclipser les inondations dévastatrices qui se sont produites en 2009 et 2010,rolex submariner occasion paris replique, a déclaré un porte-parole de la Courtenay.
De Fanny Bay à Courtenay,contrefaçon occasion rolex submariner, certaines parties de la route intérieure sont devenues dangereuses en raison de la mise en commun de l'eau. Les inondations ont forcé la fermeture du pont de la rue Fifth Street de Courtenay, avec une circulation s'étendant sur deux kilomètres.
À Port Alberni, les résidents ont signalé des inondations dans des sous-sols et des milliers de pertes de pouvoir. Les équipages municipaux ont bloqué la troisième et la quatrième avenue inférieures, où les propriétaires d'entreprises inondés se sont précipités pour faire face à l'eau de pluie qui se dégageait alors que les égouts pluviaux débordaient. Le vent a déchiré le toit des ventes automobiles de Tar sur Third Avenue et les eaux pluviales ont forcé le personnel à évacuer.
Le service d'incendie de Port Alberni, le capitaine Herb Nadig, a déclaré: 'Beaucoup d'arbres vers le bas, des arbres sur les lignes électriques'. Les pompiers ont cordonné les zones où les lignes électriques étaient en panne et leur disaient aux résidents de rester à l'intérieur. Hydro a déclaré que le vent avait éliminé le pouvoir à environ 11 000 clients dans l'île du Nord et près de 4 000 dans l'île du Sud. Le mardi soir,cadran rolex submariner replique, le pouvoir était de retour pour la plupart des clients de l'île du Sud, mais des centaines étaient encore sans électricité plus au nord. Hydro. Le vent a frappé des arbres sur des lignes électriques et a causé beaucoup à la chute, at-elle dit. Les équipages hydroélectriques en les forçant à prendre des détours pour arriver à des endroits difficiles, a déclaré Louwers. Mardi matin, Maryann Rumney a sauté du lit après avoir entendu ce qui ressemblait à des meubles qui grattaient le sol de sa maison de Port Alberni. Il s'est avéré être un arbre qui tombe sur la vieille maison en arbre de son fils. 'Nous avons vécu ici 28 ans et j'avais toujours peur qu'il ne descendît', a déclaré Rumney.
La famille a abandonné les plans pour abattre la maison de l'arbre, qui n'est plus utilisée par le fils adulte de Rumney, Aaron. 'C'est un peu triste parce que [le mari de Rumney] Ross et Aaron l'ont construit quand Aaron avait six ans , Dit-elle. Dès que je suis entré dans la porte, je pouvais sentir l'humidité et trouver quatre pouces d'eau dans le sous-sol.
La Grande Victoria s'est échappée relativement indemne.
La pluie continuera aujourd'hui dans la Grande Victoria avec une attente de 25 à 35 mm, surtout entre minuit et midi, a déclaré Doug Lundquist, météorologue d'Environnement Canada. 'Une troisième tempête pourrait rouler jeudi. Mais vendredi, l'ensemble du système prend son envol'.
Minimum d'accises pour 2WD
KUALA LUMPUR: Le gouvernement a accepté de rationaliser le taux d'accise pour les véhicules à deux et quatre roues motrices avec une capacité de moteur d'au plus 1,r��plique prix collier van cleef.500cc à 60% en vigueur immédiatement.
Dans un communiqué de presse mercredi, le Département royal des douanes de Malaisie (RMCD) a déclaré que la décision de réduire l'accise de 65% à 60% a été prise après prise en compte de la forte demande de véhicules complètement construits actuellement.
La période de transition temporaire, les modifications qui seront publiées et prendront effet à partir du 13 avril 2017,collier van cleef occasion r��plique, la suppression de plus de 60% de l'accise sera accordée pour tous les véhicules impliqués, a déclaré Datuk Indera Subromaniam Tholasy,faux collier van cleef alhambra, directeur général de RMCD.
Ce mouvement, le prix des véhicules aux acheteurs doit être maintenu et les fabricants de véhicules ne peuvent pas augmenter les prix en fonction de l'augmentation du taux d'accise qui ont été publiés dans le cadre de l'Ordonnance sur les droits d'accise 2017, le 31 mars 2017,collier van cleef and arpels imitation, at-il déclaré.
Avant cela, le RMCD dans la Gazette du gouvernement fédéral a déclaré que l'accise pour les véhicules polyvalents, les services publics de sport et la fourgonnette d'une capacité de 1,5 litre et moins ont été augmentées de 5% de 60% à 65% à compter du 1er avril. Bernama
KUALA LUMPUR: Le gouvernement a accepté de rationaliser le taux d'accise pour les véhicules à deux et quatre roues motrices avec une capacité de moteur d'au plus 1,r��plique prix collier van cleef.500cc à 60% en vigueur immédiatement.
Dans un communiqué de presse mercredi, le Département royal des douanes de Malaisie (RMCD) a déclaré que la décision de réduire l'accise de 65% à 60% a été prise après prise en compte de la forte demande de véhicules complètement construits actuellement.
La période de transition temporaire, les modifications qui seront publiées et prendront effet à partir du 13 avril 2017,collier van cleef occasion r��plique, la suppression de plus de 60% de l'accise sera accordée pour tous les véhicules impliqués, a déclaré Datuk Indera Subromaniam Tholasy,faux collier van cleef alhambra, directeur général de RMCD.
Ce mouvement, le prix des véhicules aux acheteurs doit être maintenu et les fabricants de véhicules ne peuvent pas augmenter les prix en fonction de l'augmentation du taux d'accise qui ont été publiés dans le cadre de l'Ordonnance sur les droits d'accise 2017, le 31 mars 2017,collier van cleef and arpels imitation, at-il déclaré.
Avant cela, le RMCD dans la Gazette du gouvernement fédéral a déclaré que l'accise pour les véhicules polyvalents, les services publics de sport et la fourgonnette d'une capacité de 1,5 litre et moins ont été augmentées de 5% de 60% à 65% à compter du 1er avril. Bernama
Les protéines luminescentes pour les hautes
RésuméL'utilisation de protéines fluorescentes a révolutionné notre compréhension des processus biologiques. Cependant, l'exigence d'un éclairage externe empêche leur application universelle à l'étude des processus biologiques dans tous les tissus. Bien que la lumière puisse être créée par la chimioluminescence, l'émission de lumière provenant des sondes chimioluminescentes existantes est trop faible pour utiliser cette modalité d'imagerie dans les situations où la fluorescence ne peut pas être utilisée. Ici, nous rapportons le développement de la protéine luminescente la plus brillante à ce jour, Nano lantern, qui est une chimère de Renforce luciférase améliorée et Vénus, une protéine fluorescente à haute efficacité de transfert d'énergie de résonance bioluminescence. Nano lantern permet l'imagerie en temps réel de structures intracellulaires dans des cellules vivantes avec une résolution spatiale équivalente à la fluorescence et une détection de tumeur sensible chez des souris sans cures qui se déplacent librement. Nous créons également des indicateurs fonctionnels basés sur Nano lantern qui peuvent imaginer Ca2 +, l'adénosine monophosphate cyclique et la dynamique des triphosphates d'adénosine 5 dans des environnements où l'utilisation d'indicateurs fluorescents n'est pas réalisable. Ces protéines luminescentes permettent la visualisation des phénomènes biologiques au niveau des cellules, des organes et du corps entier précédemment non visibles chez les animaux et les plantes. Introduction Bien que l'imagerie par fluorescence soit largement utilisée, sa dépendance à l'illumination externe empêche son application universelle. Par exemple, l'imagerie par fluorescence ne peut pas être utilisée facilement pour étudier les processus biologiques dépendant de la lumière, tels que la photoréduction visuelle ou la photosynthèse. Bien que l'enregistrement optique de la rétine sensible à la lumière ait été exécuté avec succès en utilisant une excitation de 2 photons avec un laser femtoseconde de 930 nm1, cette méthode n'est pas polyvalente car de nombreuses molécules biologiques ont une absorption significative aux longueurs d'onde visibles et infrarouges2. Par conséquent, les méthodes basées sur la fluorescence à la fois avec 1 photon et une excitation de 2 photons ne peuvent pas toujours être utilisées pour étudier les processus biologiques dépendants de la lumière. En outre, la fluorescence est incompatible avec l'imagerie des tissus profonds non invasifs d'organismes entiers et d'autres applications où le substrat cellulaire est autofluorescent (par exemple, les chloroplastes de plantes photosynthétiques), saturés de photopigments (hépatocytes porphyriques, mélanocytes ou épithélium pigmentaire rétinien) ou extrêmement photosensibles. Des problèmes expérimentaux surviennent également lorsqu'un éclairage externe est nécessaire, comme pour les technologies biologiques telles que l'optogenèse, l'inactivation de la lumière assistée par chromophore et la photolyse des composés en cage, ce qui empêche l'utilisation simultanée de l'imagerie par fluorescence. Enfin, la densité de puissance générale de l'éclairage externe pour la microscopie de cellules vivantes avec fluorescence (sous Wcm2) provoque parfois des effets phototoxiques dans les substrats visualisés, ce qui modifie le comportement cellulaire et mène finalement à la mort cellulaire. En revanche, la chimioluminescence génère un signal lumineux visible grâce à une réaction chimique localisée sans nécessité d'éclairage externe. Parce que les valeurs de kcat de luciférases classiques vont de 0,1 pour la luciférase de luciole (rendement quantique = 0,5) 3 à environ 4,4 pour Renilla luciferase (RLuc) 8 (rendement quantique = 0,r��plique collier trefle van cleef,053) 4, expression transitoire des concentrations micromolaires de luciférases, par exemple RLuc8 , Génère une densité de puissance de la lumière émise qui est 1/103 celle de la densité de puissance générale requise pour l'émission de fluorescence dans l'imagerie des cellules vivantes (environ 0,1 Wcm2). Par conséquent, bien que les protéines chimioluminescentes, y compris l'aequorine et les luciférases, aient été utilisées pour imaginer des cellules vivantes et des organismes 5,6, la production de lumière de ces protéines est insuffisante pour fournir une résolution spatiale et / ou temporelle équivalente à la fluorescence. Dans le cas des organismes lumineux, Tel que la pensée de la mer Renilla reniformis, le problème de la faible luminosité a été résolu dans la nature par le phénomène du transfert d'énergie par résonance bioluminescence (BRET), dans lequel l'énergie excitée d'un substrat luminescent, coelenterazine, liée à RLuc est transférée efficacement de manière intermoleculaire à L'accepteur de protéine fluorescente verte Renilla (rendement quantique = 0,3) par un mécanisme de transfert d'énergie de résonance de Frster (FRET), augmentant ainsi le nombre de photons émis environ six fois7. Sur la base de ce BRET intermoleculaire naturel, des sondes BRET intramoléculaires, telles que l'aequorine GFP8 et BAF Y9, ont été développées. Bien que ces sondes permettent l'imagerie des cellules vivantes avec une résolution améliorée dans l'espace et le temps, elles sont encore sous-performantes par rapport aux sondes à base de protéines fluorescentes en raison de la faible luminosité. Pour résoudre ce problème, nous avons obtenu un RLuc plus lumineux par mutagenèse aléatoire et fusion à une protéine fluorescente jaune (YFP) avec une efficacité BRET élevée. La protéine de fusion a montré une luminescence plus lumineuse que le BAF Y, permettant non seulement l'imagerie en temps réel des structures intracellulaires dans les cellules vivantes, mais aussi la détection de tumeurs sensibles dans une souris qui se déplace librement. De plus, nous avons développé des indicateurs de Ca2 +, de l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) et de l'adénosine 5 triphosphate (ATP) basés sur cette brillante protéine luminescente. Ces indicateurs luminescents permettront la visualisation après le contrôle optique de l'activité cellulaire ou enzymatique au niveau de la cellule unique, des organes et du corps entier chez les animaux et les plantes.RésultatsDesign et application de la protéine lumineuse lumineuse Pour améliorer la luminosité, nous avons conçu une protéine chimère basée sur eBAF Y9 (Note complémentaire 1), qui est une fusion de YFP amélioré et un RLuc amélioré, RLuc8 (4). Étant donné que l'efficacité de BRET, et donc la luminosité, dépend des propriétés photochimiques et physiques du donneur et de l'accepteur, nous avons affiné ces paramètres en améliorant la luminosité des donneurs, en maximisant le chevauchement spectral entre l'émission de donneur et l'absorbance d'accepteur à l'aide de Venus10 et en optimisant l'arrangement spatial du donneur Et accepteur dans la construction de fusion (note complémentaire 1, figure supplémentaire S1 et tableau complémentaire S1). La protéine résultante, que nous appelons Nano lantern, qui rappelle une source de lumière avec une échelle nanométrique (figure 1a), a montré une luminescence de 5,3 et 2,9 fois plus grande que RLuc8 et eBAF Y, respectivement, sur toute la plage d'émission (figure 1b). La luminosité améliorée de Nano lantern devrait générer des densités de puissance dans la gamme de 1Wcm2 (contre 0.1Wcm2 pour RLuc8) suite à une surexpression transitoire dans la gamme micromolaire dans les cellules humaines, et ainsi augmenter le potentiel d'imagerie.Figure 1: Développement de la protéine lumineuse lumineuse Nano lanterne (A) Schéma de la structure de domaine de Nano lantern. Les nombres représentent la position relative d'acide aminé dans la protéine d'origine. (B) Spectres d'émission de quantités équimolaires des protéines luminescentes Nano lantern, VRL10.3, eBAF Y9, RLuc8_S257G, RLuc8 et RLuc. Les mesures des spectres d'émission ont été effectuées au moins en trois exemplaires, et les données moyennes sont indiquées. (C) Imagerie luminescente (gauche) et fluorescence (droite) des cellules HeLa exprimant Nano lanterne ciblées sur le cytoplasme, les mitochondries et l'histone H2B. Les temps d'exposition pour les images de luminescence étaient respectivement 3s, 3s et 1s. Le temps d'exposition pour toutes les images de fluorescence était de 1 s. Le signal de fluorescence de référence a été capturé par Vénus passionnante avec de la lumière à 490 nm. Barres à l'échelle, 50 m. En effet, lorsque Nano lanterne a été exprimée dans des cellules HeLa, une image de luminescence avec une qualité presque comparable à celle des images de fluorescence a été obtenue. La lanterne Nano et les fusions avec des étiquettes de localisation définies ont permis de visualiser les compartiments cellulaires et les organites, tels que le cytoplasme, les mitochondries et le noyau (histone H2B), dans les cellules vivantes en utilisant des lentilles de faible grossissement (objectif X20 sec) avec des expositions brèves et 1 3 s ( Fig. 1c). Nano lantern a également permis de visualiser des structures plus fines, y compris des microfilaments, des microtubules et leurs conseils (EB3) avec une lentille de grossissement élevé (objectif d'immersion d'huile X60) et plus longues, 3 60s, expositions (figure supplémentaire S2). Par conséquent, le signal luminescent amélioré (Wcm2) de Nano lantern permet l'imagerie à haute résolution spatiale jusqu'à au moins le niveau subcellulaire, avec une qualité proche de celle de l'imagerie à base de protéines fluorescentes (FP). En effet, bien que la densité de puissance de la lumière émettrice de Nano lantern reste 1/102 inférieure à celle des émissions générales de fluorescence (à 100Wcm2), la qualité de l'image est définie par le rapport signal / bruit (rapport S / N). Dans l'imagerie par fluorescence, cela est compromis par des niveaux de bruit élevés provenant de la lumière d'excitation parasite et de l'autofluorescence à la fois de l'échantillon et du milieu. Dans l'imagerie chimioluminescente, la qualité ne souffre pas de faible niveau de signal en raison du très faible niveau de bruit. Étant donné que l'éclairage externe n'est pas nécessaire, un rapport S / N adéquat est conservé. À l'heure actuelle, la chimioluminescence est couramment utilisée pour la détection de tumeurs non invasives chez les souris vivantes pour la recherche sur les métastases tumorales et le dépistage anti-cancer11. Une luminescence plus brillante devrait permettre la détection de tumeurs plus petites. En effet, lorsque des lignées cellulaires du colon 26 d'adenocarcinome qui expriment de manière stable Nano lantern ou RLuc8 (colon26 / Nano lantern and colon26 / RLuc8) ont été implantées par voie sous-cutanée chez des souris nues BALB / c (figure 2a) et nous avons détecté seulement 103 cellules exprimant Nano Lantern 1 jour après la transplantation (figure 2b), qui est 1 ordre de grandeur mieux que les tumeurs exprimant RLuc8 (figure 2c). Figure 2: imagerie luminescente de souris avec des tumeurs expriment des lanternes Nano. (A) Position des cellules colon26 exprimant Nano lanterne (Cercles verts) ou RLuc8 (cercles rouges) dans les souris transplantées (vue dorsale). (B, d) Des images luminescentes représentatives des nombres indiqués de cellules injectées à 600s (b) et 1s expositions (d). (C) Comparaison dans des unités de lumière relative (RLU, pixels intégrés par s) de 1 107 cellules de colon26 / RLuc8 et Nano lantern. sont indiqués. (E) Cadres consécutifs d'images de taux vidéo de lanternes Nano exprimant des cellules tumorales dans une souris non rasée. Le signal luminescent tous les 60ms est montré en vert dans les images fixes et comme une série de pseudo-couleurs (bleu, cyan, vert, jaune, rouge et magenta) dans l'image fusionnée. Barres à l'échelle, 1 cm. La luminosité accrue de la lanterne Nano permettait l'imagerie de 105 et 106 cellules à des taux d'échantillonnage de 0,1 et 1 Hz, respectivement (figure 2d). De manière surprenante, nous pourrions même obtenir une image vidéo (30Hz) d'images des tumeurs 17 jours après l'implantation de 106 cellules tumorales dans des souris sans ailettes qui se déplacent librement (figure 2e et film supplémentaire 1). Dans les précédents rapports d'imagerie de cellules tumorales luminescentes chez des souris non anesthésiées12, les images réussies n'étaient obtenues qu'avec des souris nues, des échantillons de tumeurs plus vastes et des temps d'exposition prolongés (160 ou 200 contre 33 ms dans ce rapport). Une augmentation de la sensibilité et une imagerie plus rapide sans besoin d'anesthésie à l'aide de Nano lantern facilite grandement l'analyse de la croissance tumorale et des métastases chez les animaux vivants. Les indicateurs fonctionnels basés sur Nano lanternHaving ont démontré l'avantage des propriétés luminescentes améliorées de Nano lantern, la résolution spatiale micrométrique dans les cellules vivantes Et une meilleure résolution de la tumeur chez les animaux entiers, nous avons cherché à développer des indicateurs fonctionnels pour les molécules bioactives telles que le Ca2 +, l'AMPc et l'ATP à base de Nano lantern. Jusqu'à présent, deux types d'indices fonctionnels basés sur la chimioluminescence ont été rapportés; On utilise la complémentation de la luciférase fractionnée (CSL), dans laquelle la molécule de luciférase est divisée, une partie étant fusionnée au domaine du capteur d'une molécule bioactive et l'autre à un peptide qui lie le domaine du capteur. Ce type d'indicateur émet un signal lors de la reconstitution médiée par la molécule bioactive de la luciférase fractionnée13. L'autre utilise un indicateur basé sur BRET composé du domaine du capteur d'une molécule bioactive flanquée d'un donneur chimioluminescent intact et d'un accepteur fluorescent, dans ce cas, une réponse cellulaire est détectée comme une modification de l'efficacité BRET14. Bien que les indicateurs de type CSL aient un changement de signal plus important, leur intensité absolue est souvent trop faible pour être imagée. À l'inverse, les indicateurs de type basés sur BRET ont une intensité de signal suffisante pour l'imagerie; Cependant, son changement de signal sur la liaison de la molécule cible est généralement faible. Pour surmonter ces inconvénients, nous avons cherché à insérer un domaine de capteur dans Nano lantern pour créer un indicateur CSL / BRET hybride qui présenterait un changement de signal avec une intensité suffisante pour l'imagerie (Fig. Supplémentaire S3a). Un indicateur Ca2 + basé sur Nano lanternDans le roman Approche hybride, nous avons d'abord cherché à développer un indicateur Nano lantern pour Ca2 +, l'un des plus importants des deuxièmes messagers dans les cellules vivantes. Nous avons cloné le domaine de détection de Ca2 + (CaM M13) du cameleon jaune, un indicateur établi de Ca2 + basé sur FRET15, et cherché le site d'insertion optimal dans la lanterne Nano qui produirait un grand changement de signal et préserverait les émissions de haute intensité. D'autres propriétés importantes, y compris l'affinité au Ca2 + et la réversibilité de l'activité catalytique de la luciférase, ont également été examinées. En fin de compte, sur les sites testés, nous avons constaté que les insertions dans la boucle non structurale Gly228 / Gly229 dans RLuc8 qui relie les domaines de l'hydrolase et du bouchon étaient bien tolérées (Fig. Supplémentaire S3b et Note complémentaire 2). La construction résultante, nommée Nano lantern (Ca2 +), a montré un changement de signal de 300% à une luminosité de 35% de la protéine parentale aux concentrations de Ca2 + saturées (figure 3a). Les affinités Ca2 + de Nano lantern (Ca2 +) et ses dérivés (Schéma complémentaire S4 et Tableau complémentaire S2) étaient presque identiques à ceux de la série de couches virées jaunes parentales, ce qui suggère que la reconstitution de Rluc8 fractionné dans Nano lantern (Ca2 +) n'a pas entravé Le changement de conformation induite par Ca2 + dans le domaine CaM M13 (note complémentaire 2). sont indiqués. (C) Une série d'images du rapport pseudo-coloré des cellules HeLa exprimant Nano lantern (Ca2 +) prises à la vitesse vidéo,prix collier alhambra van cleef r��plique, après stimulation de l'histamine. Bar à l'échelle, 10 m. (D) Durée du changement de ratio L / L0 à un retour sur investissement (case blanche en (c)) dans une lanterne Nano Lan Lan (Ca2 +) HeLa. Le numéro indique le point de temps de chaque image dans (c). Les données représentatives d'au moins cinq expériences sont indiquées en (d) et (e). (E) Un temps typique du changement de ratio spatial L / L0 dans les ROI (cyan, magenta et jaune cases dans (c)) dans une autre cellule HeLa. (F) Temps de changement du rapport L / L0 dans un neurone hippocampeux de rat co exaltant Nano lantern (Ca2 +) avec le ChR2. ChR2 a été activé à plusieurs reprises dans les sessions d'illumination (2s), consistant en 15 cycles d'exposition de la caméra (100ms) et des impulsions de lumière bleue (0.8ms) qui ont été livrées pendant les périodes (30ms) lorsque l'exposition de la caméra était éteinte. Les chiffres indiquent les points de temps de chaque image dans (g). Les données représentatives de cinq mesures sont affichées. (G) Une série d'images du rapport pseudo-coloré d'un neurone hippocampeux de rat qui exprime la lanterne Nano (Ca2 +). Barre d'échelle, 10m. Pour comparer les performances de cet indicateur Ca2 + à une norme connue, nous avons exprimé Nano lantern (Ca2 +) dans les cellules HeLa. À la suite d'une stimulation avec l'histamine 10M, une pointe aiguë de Ca2 + (S / N = 70) suivie d'oscillations Ca2 + avec des amplitudes plus petites (S / N = 29) a été détectée avec un taux d'échantillonnage aussi rapide que 30 Hz (figure 3c). On pourrait même observer la propagation d'une onde cytoplasmique Ca2 + d'une extrémité de la cellule à l'autre,faux collier van cleef, comme on l'a déjà observé en utilisant le cameleon jaune 15 (figure 3e et film complémentaire 2). Les oscillations Ca2 + induites par l'histaminine ont été supprimées par l'addition de l'antagoniste du récepteur de l'histamine cyproheptadine, confirmant que le changement du signal luminescent reflète les changements dans le cytoplasme [Ca2 +] (figure supplémentaire S5). Les indicateurs antérieurs de Ca2 + basés sur CSL13 n'étaient pas totalement réversibles en réponse à la libération de Ca2 + physiologique ou stimulée. Nous avons confirmé par imagerie Nano lantern (Ca2 +) avec R GECO116 que la cinétique de Nano lantern (Ca2 +) est parallèle à celle des sondes à base de fluorescence (figure supplémentaire S6). De manière encourageante, Nano lantern (Ca2 +), exprimé dans des neurones d'hippocampe de rat dissociés (figure supplémentaire S7), et imagé à 10 Hz, pourrait signaler des pics cytoplasmiques [Ca2 +] spontanés et des changements transitoires (Ca2 +) dus à une stimulation réversible (50 mM KCl). Pour réaliser l'avantage théorique de l'imagerie Ca2 + à l'aide de sondes de luminescence sur des indicateurs basés sur la fluorescence, nous avons réalisé une imagerie Ca2 + combinée au contrôle de l'activité neuronale à l'aide d'outils opto-génétiques. L'expression ectopique des protéines photoréceptrices, telles que l'halorhodopsine et la canalrhodopsine2 (ChR2), a permis l'analyse fonctionnelle des cellules neuronales et de leurs réseaux avec la résolution du temps ms17. Pourtant, ces outils sont spectralement incompatibles avec les indicateurs Ca2 + fluorescents. La lumière d'excitation peut être utilisée soit pour contrôler le photorécepteur, soit pour mesurer le transitoire Ca2 +, mais pas pour les deux dans la même cellule en même temps. Parce que l'imagerie de luminescence peut être effectuée en l'absence de lumière externe, elle peut être associée à une stratégie opto-génétique sans interférence indésirable due à l'activité du photorécepteur. Pour démontrer cela, nous avons exprimé Nano lantern (Ca2 +) et ChR2 dans des neurones d'hippocampe de rat dissociés. Le signal luminescent a été imaginé tous les 100ms et ChR2 a été activé avec une impulsion de 0,8 ms de lumière bleue (438nm) pendant le temps mort de la puce CCD pour le transfert de données18. En réponse à 15 cycles de lumière d'activation,collier van cleef and arpels r��plique, une augmentation rapide a été observée dans le signal luminescent (figure 3f et film supplémentaire 3). Nous avons également détecté une diminution progressive du signal au niveau basal lorsque l'illumination a été terminée. La consommation catalytique du substrat (coelenterazine h) entraîne une diminution progressive de la ligne de base et de l'amplitude des transitoires. Ces résultats suggèrent que ces outils de neurobiologie synergiques peuvent maintenant être combinés en une seule approche expérimentale. À l'avenir, il est possible également de combiner d'autres systèmes de contrôle optique, tels que l'inactivation de la lumière assistée par chromophore des molécules cibles19 et la photolyse des composés en cage20, avec des indicateurs fonctionnels luminescents. Indicateurs améliorés d'AMPc basés sur Nano lanternImaging AMPc intracellulaire, un autre second messenger important , L'utilisation d'indicateurs fluorescents a été difficile en raison du faible changement de signal (1 15%) avec les indicateurs actuels basés sur FP 21,22,23. Pour examiner si la stratégie hybride CSL / BRET pourrait être appliquée pour construire un indicateur d'AMPc haute performance, nous avons cloné une série de motifs de liaison AMPc de la sous-unité régulatrice PKA ou EPAC1, dans Nano lantern au poste 228/229 (similaire à Nano Lanterne (Ca2 +)) (figure supplémentaire S8a). Les protéines recombinantes ont été purifiées et criblées pour des changements d'intensité en réponse à l'AMPc. Parmi les neuf constructions testées, trois motifs de reconnaissance d'AMPc ont donné un changement de signal important avec des affinités distinctes d'AMPc (Kd = 0,4, 1,6 et 3,3M) et une de ces trois lanternes Nano contenant un fragment d'EPAC1 (G170 à A327 avec Q270E) , Que nous avons appelé Nano lantern (cAMP1.6) (de son Kd), a montré la plus grande augmentation du signal (130%) lors de la stimulation AMPc (figure 4a, figure supplémentaire S8b d et note complémentaire 3). En revanche, les indicateurs basés sur FRET avec un domaine de reconnaissance d'AMPc identique n'ont montré qu'un petit changement de signal (11,7% pour les constructions basées sur le CFP / YFP, la Figure supplémentaire S8e et la Note complémentaire 3). Figure 4: Développement d'un indicateur AMC luminescent à la lanterne Nano . (A) Schéma de la structure de domaine de Nano lantern (cAMP). (B) Brillance relative de la lanterne Nano recombinante et de la lanterne Nano (AMPc) avec ou sans cAMP. sont indiqués. (C) Une image AMPc de 100 000 cellules D. discoideum exprimant Nano lantern (cAMP1.6) pendant la morphogenèse agrégée. Barre d'échelle, 1mm. (D) L'espace et le temps parcourent les lignes jaunes indiquées en (c) pendant 60 minutes. (E) Durée du changement d'intensité de la luminescence aux ROI indiqués en (c). Ce sont des données typiques à partir de cinq mesures. Pour examiner la capacité de Nano lantern (cAMP1.6) à détecter les changements intracellulaires de la concentration d'AMPc, nous avons utilisé les cellules Dictyostelium discoideum car la concentration cytoplasmique d'AMPc (ci-après [AMPc]) dans les cellules Dictyostelium augmente en réponse à l'extracellulaire Stimulation AMPc24,25, ce qui augmente indirectement [cAMP] thRugueuse
RésuméL'utilisation de protéines fluorescentes a révolutionné notre compréhension des processus biologiques. Cependant, l'exigence d'un éclairage externe empêche leur application universelle à l'étude des processus biologiques dans tous les tissus. Bien que la lumière puisse être créée par la chimioluminescence, l'émission de lumière provenant des sondes chimioluminescentes existantes est trop faible pour utiliser cette modalité d'imagerie dans les situations où la fluorescence ne peut pas être utilisée. Ici, nous rapportons le développement de la protéine luminescente la plus brillante à ce jour, Nano lantern, qui est une chimère de Renforce luciférase améliorée et Vénus, une protéine fluorescente à haute efficacité de transfert d'énergie de résonance bioluminescence. Nano lantern permet l'imagerie en temps réel de structures intracellulaires dans des cellules vivantes avec une résolution spatiale équivalente à la fluorescence et une détection de tumeur sensible chez des souris sans cures qui se déplacent librement. Nous créons également des indicateurs fonctionnels basés sur Nano lantern qui peuvent imaginer Ca2 +, l'adénosine monophosphate cyclique et la dynamique des triphosphates d'adénosine 5 dans des environnements où l'utilisation d'indicateurs fluorescents n'est pas réalisable. Ces protéines luminescentes permettent la visualisation des phénomènes biologiques au niveau des cellules, des organes et du corps entier précédemment non visibles chez les animaux et les plantes. Introduction Bien que l'imagerie par fluorescence soit largement utilisée, sa dépendance à l'illumination externe empêche son application universelle. Par exemple, l'imagerie par fluorescence ne peut pas être utilisée facilement pour étudier les processus biologiques dépendant de la lumière, tels que la photoréduction visuelle ou la photosynthèse. Bien que l'enregistrement optique de la rétine sensible à la lumière ait été exécuté avec succès en utilisant une excitation de 2 photons avec un laser femtoseconde de 930 nm1, cette méthode n'est pas polyvalente car de nombreuses molécules biologiques ont une absorption significative aux longueurs d'onde visibles et infrarouges2. Par conséquent, les méthodes basées sur la fluorescence à la fois avec 1 photon et une excitation de 2 photons ne peuvent pas toujours être utilisées pour étudier les processus biologiques dépendants de la lumière. En outre, la fluorescence est incompatible avec l'imagerie des tissus profonds non invasifs d'organismes entiers et d'autres applications où le substrat cellulaire est autofluorescent (par exemple, les chloroplastes de plantes photosynthétiques), saturés de photopigments (hépatocytes porphyriques, mélanocytes ou épithélium pigmentaire rétinien) ou extrêmement photosensibles. Des problèmes expérimentaux surviennent également lorsqu'un éclairage externe est nécessaire, comme pour les technologies biologiques telles que l'optogenèse, l'inactivation de la lumière assistée par chromophore et la photolyse des composés en cage, ce qui empêche l'utilisation simultanée de l'imagerie par fluorescence. Enfin, la densité de puissance générale de l'éclairage externe pour la microscopie de cellules vivantes avec fluorescence (sous Wcm2) provoque parfois des effets phototoxiques dans les substrats visualisés, ce qui modifie le comportement cellulaire et mène finalement à la mort cellulaire. En revanche, la chimioluminescence génère un signal lumineux visible grâce à une réaction chimique localisée sans nécessité d'éclairage externe. Parce que les valeurs de kcat de luciférases classiques vont de 0,1 pour la luciférase de luciole (rendement quantique = 0,5) 3 à environ 4,4 pour Renilla luciferase (RLuc) 8 (rendement quantique = 0,r��plique collier trefle van cleef,053) 4, expression transitoire des concentrations micromolaires de luciférases, par exemple RLuc8 , Génère une densité de puissance de la lumière émise qui est 1/103 celle de la densité de puissance générale requise pour l'émission de fluorescence dans l'imagerie des cellules vivantes (environ 0,1 Wcm2). Par conséquent, bien que les protéines chimioluminescentes, y compris l'aequorine et les luciférases, aient été utilisées pour imaginer des cellules vivantes et des organismes 5,6, la production de lumière de ces protéines est insuffisante pour fournir une résolution spatiale et / ou temporelle équivalente à la fluorescence. Dans le cas des organismes lumineux, Tel que la pensée de la mer Renilla reniformis, le problème de la faible luminosité a été résolu dans la nature par le phénomène du transfert d'énergie par résonance bioluminescence (BRET), dans lequel l'énergie excitée d'un substrat luminescent, coelenterazine, liée à RLuc est transférée efficacement de manière intermoleculaire à L'accepteur de protéine fluorescente verte Renilla (rendement quantique = 0,3) par un mécanisme de transfert d'énergie de résonance de Frster (FRET), augmentant ainsi le nombre de photons émis environ six fois7. Sur la base de ce BRET intermoleculaire naturel, des sondes BRET intramoléculaires, telles que l'aequorine GFP8 et BAF Y9, ont été développées. Bien que ces sondes permettent l'imagerie des cellules vivantes avec une résolution améliorée dans l'espace et le temps, elles sont encore sous-performantes par rapport aux sondes à base de protéines fluorescentes en raison de la faible luminosité. Pour résoudre ce problème, nous avons obtenu un RLuc plus lumineux par mutagenèse aléatoire et fusion à une protéine fluorescente jaune (YFP) avec une efficacité BRET élevée. La protéine de fusion a montré une luminescence plus lumineuse que le BAF Y, permettant non seulement l'imagerie en temps réel des structures intracellulaires dans les cellules vivantes, mais aussi la détection de tumeurs sensibles dans une souris qui se déplace librement. De plus, nous avons développé des indicateurs de Ca2 +, de l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) et de l'adénosine 5 triphosphate (ATP) basés sur cette brillante protéine luminescente. Ces indicateurs luminescents permettront la visualisation après le contrôle optique de l'activité cellulaire ou enzymatique au niveau de la cellule unique, des organes et du corps entier chez les animaux et les plantes.RésultatsDesign et application de la protéine lumineuse lumineuse Pour améliorer la luminosité, nous avons conçu une protéine chimère basée sur eBAF Y9 (Note complémentaire 1), qui est une fusion de YFP amélioré et un RLuc amélioré, RLuc8 (4). Étant donné que l'efficacité de BRET, et donc la luminosité, dépend des propriétés photochimiques et physiques du donneur et de l'accepteur, nous avons affiné ces paramètres en améliorant la luminosité des donneurs, en maximisant le chevauchement spectral entre l'émission de donneur et l'absorbance d'accepteur à l'aide de Venus10 et en optimisant l'arrangement spatial du donneur Et accepteur dans la construction de fusion (note complémentaire 1, figure supplémentaire S1 et tableau complémentaire S1). La protéine résultante, que nous appelons Nano lantern, qui rappelle une source de lumière avec une échelle nanométrique (figure 1a), a montré une luminescence de 5,3 et 2,9 fois plus grande que RLuc8 et eBAF Y, respectivement, sur toute la plage d'émission (figure 1b). La luminosité améliorée de Nano lantern devrait générer des densités de puissance dans la gamme de 1Wcm2 (contre 0.1Wcm2 pour RLuc8) suite à une surexpression transitoire dans la gamme micromolaire dans les cellules humaines, et ainsi augmenter le potentiel d'imagerie.Figure 1: Développement de la protéine lumineuse lumineuse Nano lanterne (A) Schéma de la structure de domaine de Nano lantern. Les nombres représentent la position relative d'acide aminé dans la protéine d'origine. (B) Spectres d'émission de quantités équimolaires des protéines luminescentes Nano lantern, VRL10.3, eBAF Y9, RLuc8_S257G, RLuc8 et RLuc. Les mesures des spectres d'émission ont été effectuées au moins en trois exemplaires, et les données moyennes sont indiquées. (C) Imagerie luminescente (gauche) et fluorescence (droite) des cellules HeLa exprimant Nano lanterne ciblées sur le cytoplasme, les mitochondries et l'histone H2B. Les temps d'exposition pour les images de luminescence étaient respectivement 3s, 3s et 1s. Le temps d'exposition pour toutes les images de fluorescence était de 1 s. Le signal de fluorescence de référence a été capturé par Vénus passionnante avec de la lumière à 490 nm. Barres à l'échelle, 50 m. En effet, lorsque Nano lanterne a été exprimée dans des cellules HeLa, une image de luminescence avec une qualité presque comparable à celle des images de fluorescence a été obtenue. La lanterne Nano et les fusions avec des étiquettes de localisation définies ont permis de visualiser les compartiments cellulaires et les organites, tels que le cytoplasme, les mitochondries et le noyau (histone H2B), dans les cellules vivantes en utilisant des lentilles de faible grossissement (objectif X20 sec) avec des expositions brèves et 1 3 s ( Fig. 1c). Nano lantern a également permis de visualiser des structures plus fines, y compris des microfilaments, des microtubules et leurs conseils (EB3) avec une lentille de grossissement élevé (objectif d'immersion d'huile X60) et plus longues, 3 60s, expositions (figure supplémentaire S2). Par conséquent, le signal luminescent amélioré (Wcm2) de Nano lantern permet l'imagerie à haute résolution spatiale jusqu'à au moins le niveau subcellulaire, avec une qualité proche de celle de l'imagerie à base de protéines fluorescentes (FP). En effet, bien que la densité de puissance de la lumière émettrice de Nano lantern reste 1/102 inférieure à celle des émissions générales de fluorescence (à 100Wcm2), la qualité de l'image est définie par le rapport signal / bruit (rapport S / N). Dans l'imagerie par fluorescence, cela est compromis par des niveaux de bruit élevés provenant de la lumière d'excitation parasite et de l'autofluorescence à la fois de l'échantillon et du milieu. Dans l'imagerie chimioluminescente, la qualité ne souffre pas de faible niveau de signal en raison du très faible niveau de bruit. Étant donné que l'éclairage externe n'est pas nécessaire, un rapport S / N adéquat est conservé. À l'heure actuelle, la chimioluminescence est couramment utilisée pour la détection de tumeurs non invasives chez les souris vivantes pour la recherche sur les métastases tumorales et le dépistage anti-cancer11. Une luminescence plus brillante devrait permettre la détection de tumeurs plus petites. En effet, lorsque des lignées cellulaires du colon 26 d'adenocarcinome qui expriment de manière stable Nano lantern ou RLuc8 (colon26 / Nano lantern and colon26 / RLuc8) ont été implantées par voie sous-cutanée chez des souris nues BALB / c (figure 2a) et nous avons détecté seulement 103 cellules exprimant Nano Lantern 1 jour après la transplantation (figure 2b), qui est 1 ordre de grandeur mieux que les tumeurs exprimant RLuc8 (figure 2c). Figure 2: imagerie luminescente de souris avec des tumeurs expriment des lanternes Nano. (A) Position des cellules colon26 exprimant Nano lanterne (Cercles verts) ou RLuc8 (cercles rouges) dans les souris transplantées (vue dorsale). (B, d) Des images luminescentes représentatives des nombres indiqués de cellules injectées à 600s (b) et 1s expositions (d). (C) Comparaison dans des unités de lumière relative (RLU, pixels intégrés par s) de 1 107 cellules de colon26 / RLuc8 et Nano lantern. sont indiqués. (E) Cadres consécutifs d'images de taux vidéo de lanternes Nano exprimant des cellules tumorales dans une souris non rasée. Le signal luminescent tous les 60ms est montré en vert dans les images fixes et comme une série de pseudo-couleurs (bleu, cyan, vert, jaune, rouge et magenta) dans l'image fusionnée. Barres à l'échelle, 1 cm. La luminosité accrue de la lanterne Nano permettait l'imagerie de 105 et 106 cellules à des taux d'échantillonnage de 0,1 et 1 Hz, respectivement (figure 2d). De manière surprenante, nous pourrions même obtenir une image vidéo (30Hz) d'images des tumeurs 17 jours après l'implantation de 106 cellules tumorales dans des souris sans ailettes qui se déplacent librement (figure 2e et film supplémentaire 1). Dans les précédents rapports d'imagerie de cellules tumorales luminescentes chez des souris non anesthésiées12, les images réussies n'étaient obtenues qu'avec des souris nues, des échantillons de tumeurs plus vastes et des temps d'exposition prolongés (160 ou 200 contre 33 ms dans ce rapport). Une augmentation de la sensibilité et une imagerie plus rapide sans besoin d'anesthésie à l'aide de Nano lantern facilite grandement l'analyse de la croissance tumorale et des métastases chez les animaux vivants. Les indicateurs fonctionnels basés sur Nano lanternHaving ont démontré l'avantage des propriétés luminescentes améliorées de Nano lantern, la résolution spatiale micrométrique dans les cellules vivantes Et une meilleure résolution de la tumeur chez les animaux entiers, nous avons cherché à développer des indicateurs fonctionnels pour les molécules bioactives telles que le Ca2 +, l'AMPc et l'ATP à base de Nano lantern. Jusqu'à présent, deux types d'indices fonctionnels basés sur la chimioluminescence ont été rapportés; On utilise la complémentation de la luciférase fractionnée (CSL), dans laquelle la molécule de luciférase est divisée, une partie étant fusionnée au domaine du capteur d'une molécule bioactive et l'autre à un peptide qui lie le domaine du capteur. Ce type d'indicateur émet un signal lors de la reconstitution médiée par la molécule bioactive de la luciférase fractionnée13. L'autre utilise un indicateur basé sur BRET composé du domaine du capteur d'une molécule bioactive flanquée d'un donneur chimioluminescent intact et d'un accepteur fluorescent, dans ce cas, une réponse cellulaire est détectée comme une modification de l'efficacité BRET14. Bien que les indicateurs de type CSL aient un changement de signal plus important, leur intensité absolue est souvent trop faible pour être imagée. À l'inverse, les indicateurs de type basés sur BRET ont une intensité de signal suffisante pour l'imagerie; Cependant, son changement de signal sur la liaison de la molécule cible est généralement faible. Pour surmonter ces inconvénients, nous avons cherché à insérer un domaine de capteur dans Nano lantern pour créer un indicateur CSL / BRET hybride qui présenterait un changement de signal avec une intensité suffisante pour l'imagerie (Fig. Supplémentaire S3a). Un indicateur Ca2 + basé sur Nano lanternDans le roman Approche hybride, nous avons d'abord cherché à développer un indicateur Nano lantern pour Ca2 +, l'un des plus importants des deuxièmes messagers dans les cellules vivantes. Nous avons cloné le domaine de détection de Ca2 + (CaM M13) du cameleon jaune, un indicateur établi de Ca2 + basé sur FRET15, et cherché le site d'insertion optimal dans la lanterne Nano qui produirait un grand changement de signal et préserverait les émissions de haute intensité. D'autres propriétés importantes, y compris l'affinité au Ca2 + et la réversibilité de l'activité catalytique de la luciférase, ont également été examinées. En fin de compte, sur les sites testés, nous avons constaté que les insertions dans la boucle non structurale Gly228 / Gly229 dans RLuc8 qui relie les domaines de l'hydrolase et du bouchon étaient bien tolérées (Fig. Supplémentaire S3b et Note complémentaire 2). La construction résultante, nommée Nano lantern (Ca2 +), a montré un changement de signal de 300% à une luminosité de 35% de la protéine parentale aux concentrations de Ca2 + saturées (figure 3a). Les affinités Ca2 + de Nano lantern (Ca2 +) et ses dérivés (Schéma complémentaire S4 et Tableau complémentaire S2) étaient presque identiques à ceux de la série de couches virées jaunes parentales, ce qui suggère que la reconstitution de Rluc8 fractionné dans Nano lantern (Ca2 +) n'a pas entravé Le changement de conformation induite par Ca2 + dans le domaine CaM M13 (note complémentaire 2). sont indiqués. (C) Une série d'images du rapport pseudo-coloré des cellules HeLa exprimant Nano lantern (Ca2 +) prises à la vitesse vidéo,prix collier alhambra van cleef r��plique, après stimulation de l'histamine. Bar à l'échelle, 10 m. (D) Durée du changement de ratio L / L0 à un retour sur investissement (case blanche en (c)) dans une lanterne Nano Lan Lan (Ca2 +) HeLa. Le numéro indique le point de temps de chaque image dans (c). Les données représentatives d'au moins cinq expériences sont indiquées en (d) et (e). (E) Un temps typique du changement de ratio spatial L / L0 dans les ROI (cyan, magenta et jaune cases dans (c)) dans une autre cellule HeLa. (F) Temps de changement du rapport L / L0 dans un neurone hippocampeux de rat co exaltant Nano lantern (Ca2 +) avec le ChR2. ChR2 a été activé à plusieurs reprises dans les sessions d'illumination (2s), consistant en 15 cycles d'exposition de la caméra (100ms) et des impulsions de lumière bleue (0.8ms) qui ont été livrées pendant les périodes (30ms) lorsque l'exposition de la caméra était éteinte. Les chiffres indiquent les points de temps de chaque image dans (g). Les données représentatives de cinq mesures sont affichées. (G) Une série d'images du rapport pseudo-coloré d'un neurone hippocampeux de rat qui exprime la lanterne Nano (Ca2 +). Barre d'échelle, 10m. Pour comparer les performances de cet indicateur Ca2 + à une norme connue, nous avons exprimé Nano lantern (Ca2 +) dans les cellules HeLa. À la suite d'une stimulation avec l'histamine 10M, une pointe aiguë de Ca2 + (S / N = 70) suivie d'oscillations Ca2 + avec des amplitudes plus petites (S / N = 29) a été détectée avec un taux d'échantillonnage aussi rapide que 30 Hz (figure 3c). On pourrait même observer la propagation d'une onde cytoplasmique Ca2 + d'une extrémité de la cellule à l'autre,faux collier van cleef, comme on l'a déjà observé en utilisant le cameleon jaune 15 (figure 3e et film complémentaire 2). Les oscillations Ca2 + induites par l'histaminine ont été supprimées par l'addition de l'antagoniste du récepteur de l'histamine cyproheptadine, confirmant que le changement du signal luminescent reflète les changements dans le cytoplasme [Ca2 +] (figure supplémentaire S5). Les indicateurs antérieurs de Ca2 + basés sur CSL13 n'étaient pas totalement réversibles en réponse à la libération de Ca2 + physiologique ou stimulée. Nous avons confirmé par imagerie Nano lantern (Ca2 +) avec R GECO116 que la cinétique de Nano lantern (Ca2 +) est parallèle à celle des sondes à base de fluorescence (figure supplémentaire S6). De manière encourageante, Nano lantern (Ca2 +), exprimé dans des neurones d'hippocampe de rat dissociés (figure supplémentaire S7), et imagé à 10 Hz, pourrait signaler des pics cytoplasmiques [Ca2 +] spontanés et des changements transitoires (Ca2 +) dus à une stimulation réversible (50 mM KCl). Pour réaliser l'avantage théorique de l'imagerie Ca2 + à l'aide de sondes de luminescence sur des indicateurs basés sur la fluorescence, nous avons réalisé une imagerie Ca2 + combinée au contrôle de l'activité neuronale à l'aide d'outils opto-génétiques. L'expression ectopique des protéines photoréceptrices, telles que l'halorhodopsine et la canalrhodopsine2 (ChR2), a permis l'analyse fonctionnelle des cellules neuronales et de leurs réseaux avec la résolution du temps ms17. Pourtant, ces outils sont spectralement incompatibles avec les indicateurs Ca2 + fluorescents. La lumière d'excitation peut être utilisée soit pour contrôler le photorécepteur, soit pour mesurer le transitoire Ca2 +, mais pas pour les deux dans la même cellule en même temps. Parce que l'imagerie de luminescence peut être effectuée en l'absence de lumière externe, elle peut être associée à une stratégie opto-génétique sans interférence indésirable due à l'activité du photorécepteur. Pour démontrer cela, nous avons exprimé Nano lantern (Ca2 +) et ChR2 dans des neurones d'hippocampe de rat dissociés. Le signal luminescent a été imaginé tous les 100ms et ChR2 a été activé avec une impulsion de 0,8 ms de lumière bleue (438nm) pendant le temps mort de la puce CCD pour le transfert de données18. En réponse à 15 cycles de lumière d'activation,collier van cleef and arpels r��plique, une augmentation rapide a été observée dans le signal luminescent (figure 3f et film supplémentaire 3). Nous avons également détecté une diminution progressive du signal au niveau basal lorsque l'illumination a été terminée. La consommation catalytique du substrat (coelenterazine h) entraîne une diminution progressive de la ligne de base et de l'amplitude des transitoires. Ces résultats suggèrent que ces outils de neurobiologie synergiques peuvent maintenant être combinés en une seule approche expérimentale. À l'avenir, il est possible également de combiner d'autres systèmes de contrôle optique, tels que l'inactivation de la lumière assistée par chromophore des molécules cibles19 et la photolyse des composés en cage20, avec des indicateurs fonctionnels luminescents. Indicateurs améliorés d'AMPc basés sur Nano lanternImaging AMPc intracellulaire, un autre second messenger important , L'utilisation d'indicateurs fluorescents a été difficile en raison du faible changement de signal (1 15%) avec les indicateurs actuels basés sur FP 21,22,23. Pour examiner si la stratégie hybride CSL / BRET pourrait être appliquée pour construire un indicateur d'AMPc haute performance, nous avons cloné une série de motifs de liaison AMPc de la sous-unité régulatrice PKA ou EPAC1, dans Nano lantern au poste 228/229 (similaire à Nano Lanterne (Ca2 +)) (figure supplémentaire S8a). Les protéines recombinantes ont été purifiées et criblées pour des changements d'intensité en réponse à l'AMPc. Parmi les neuf constructions testées, trois motifs de reconnaissance d'AMPc ont donné un changement de signal important avec des affinités distinctes d'AMPc (Kd = 0,4, 1,6 et 3,3M) et une de ces trois lanternes Nano contenant un fragment d'EPAC1 (G170 à A327 avec Q270E) , Que nous avons appelé Nano lantern (cAMP1.6) (de son Kd), a montré la plus grande augmentation du signal (130%) lors de la stimulation AMPc (figure 4a, figure supplémentaire S8b d et note complémentaire 3). En revanche, les indicateurs basés sur FRET avec un domaine de reconnaissance d'AMPc identique n'ont montré qu'un petit changement de signal (11,7% pour les constructions basées sur le CFP / YFP, la Figure supplémentaire S8e et la Note complémentaire 3). Figure 4: Développement d'un indicateur AMC luminescent à la lanterne Nano . (A) Schéma de la structure de domaine de Nano lantern (cAMP). (B) Brillance relative de la lanterne Nano recombinante et de la lanterne Nano (AMPc) avec ou sans cAMP. sont indiqués. (C) Une image AMPc de 100 000 cellules D. discoideum exprimant Nano lantern (cAMP1.6) pendant la morphogenèse agrégée. Barre d'échelle, 1mm. (D) L'espace et le temps parcourent les lignes jaunes indiquées en (c) pendant 60 minutes. (E) Durée du changement d'intensité de la luminescence aux ROI indiqués en (c). Ce sont des données typiques à partir de cinq mesures. Pour examiner la capacité de Nano lantern (cAMP1.6) à détecter les changements intracellulaires de la concentration d'AMPc, nous avons utilisé les cellules Dictyostelium discoideum car la concentration cytoplasmique d'AMPc (ci-après [AMPc]) dans les cellules Dictyostelium augmente en réponse à l'extracellulaire Stimulation AMPc24,25, ce qui augmente indirectement [cAMP] thRugueuse