Preuves expérimentales de la pollinisation dans les fleurs marines

Résumé Le transport aérien par flux d'eau (hydrophile) est une adaptation typique et presque exclusive des plantes à la vie dans le milieu marin. On pense que, contrairement aux environnements terrestres, les animaux ne sont pas impliqués dans la pollinisation dans la mer. Les fleurs mâles de l'angiosperme marin tropical Thalassia testudinum s'ouvrent et libèrent du pollen dans le mucilage la nuit lorsque la faune des invertébrés est active. Nous présentons ici des preuves expérimentales selon lesquelles, en l'absence de flux d'eau, ces invertébrés visitent les fleurs, transportent et transfèrent de la masse mucilée avec du pollen incorporé des fleurs mâles aux stigmates des fleurs femelles. Les tubes de pollen sont formés sur les stigmates, ce qui indique que la pollinisation est couronnée de succès. Ainsi, T. testudinum a mélangé la pollinisation biotique abiotique. Nous proposons un syndrome de pollinisation zoobenthophilé (transfert de pollen dans la zone benthique par des animaux invertébrés) qui partage de nombreuses caractéristiques avec hydrophie, mais les fleurs devraient s'ouvrir pendant la nuit.IntroductionPollination est un processus clé dans le cycle de vie des plantes à fleurs (angiospermes) . Il s'agit généralement d'un vecteur responsable du transport qui peut être soit biotique (animaux) soit abiotique: habituellement le vent. Un autre vecteur abiotique est l'écoulement d'eau sous la surface de l'eau, qui est nommé hydrophine réelle (ou pollinisation hydrophile). L'hydrophilie ne se produit que dans 14 des 14 000 genres d'angiospermes et 10 de ces 14 genres se produisent dans le milieu marin1. Les plantes flottantes dans le milieu marin sont communément appelées seagrasses2. Toutes les espèces de graminées marines, mais une, sont vraiment hydrophiles1; Bien que certains puissent également polliniser à la surface de l'eau lorsqu'ils augmentent ou juste en dessous de la zone intertidale3. Les gravières constituent des prairies étendues dans les eaux marines peu profondes; Et sont parmi les écosystèmes les plus productifs du monde. Ils améliorent la transparence de l'eau, stabilisent les côtes et stockent du carbone, et fournissent également de la nourriture et des abris à une communauté faunique diversifiée4. Les graines de seagrasses sont des plantes clonales et la floraison a longtemps été considérée comme peu importante Groupe de plantes5. Mais progressivement, ce paradigme de l'insignifiance de la reproduction sexuelle a changé. Les marqueurs génétiques nouvellement développés ont révélé que les populations de graminées peuvent être génétiquement très variables. En outre, la reproduction sexuelle est importante pour la colonisation après des perturbations majeures et le maintien de la Le flux de gènes parmi les populations6. Cependant, la connaissance des processus impliqués dans la reproduction et la pollinisation des grappes de sérum est encore limitée1, ce qui peut être attribué en partie à l'imprudence des fleurs2. En outre, les fleurs de graminées sont éphémères une fois qu'elles se sont ouvertes, ce qui peut être Une conséquence de la floraison dans un milieu aqueux; en variante, il peut s'agir d'une adaptation Pour synchroniser la reproduction optimisant les chances de fertilisation7 et / ou éviter la prédation par le poisson8. Une suite d'adaptations florales est associée au transport du pollen à l'eau, comme la séparation des structures masculines et féminines dans différentes fleurs sur la même plante (monoecy) Ou des plantes différentes (dioïques) et des perianths réduits. Les fleurs femelles ont un tentacule comme la stigmate, et les fleurs mâles produisent du pollen copieux. Le pollen avec une couche exine réduite est soit allongé (filiforme) soit sphérique libéré dans des brins allongés de mucilage1,3,5,7. Thalassia testudinum, espèce à l'étude, est l'herbage dominant dans les Caraïbes et l'Atlantique occidental subtropical. Il est dioïque avec des plantes mâles et femelles séparées avec des fleurs situées à 1 2 cm au-dessus du fond de la mer au sein de la canopée. Les fleurs mâles se produisent dans des grappes d'une à cinq fleurs (généralement deux ou trois) et produisent dans l'ordre de 1,6 105 pollen par fleur7. Les grains de pollen (diamètre 56m) sont libérés dans des brins ou des masses de mucilage neutre et neutre7,9. Les fleurs femelles se produisent habituellement avec un ovaire inférieur au-dessous du niveau des sédiments qui se développe en un fruit relativement important (diamètre 20 25 mm) avec 1 6 (habituellement 2 4) graines. Les fleurs mâles s'ouvrent au coucher du soleil et libèrent le pollen dans 1 heure 2h à la nuit9,10. Les fleurs femelles s'ouvrent pendant la journée et sont viables jusqu'à 72h (réf. 7). Jusqu'à récemment,rolex daytona bleu replique, on pensait que dans la mer, contrairement aux environnements terrestres, les animaux ne sont pas impliqués dans la pollinisation. Cependant, van Tussenbroek et al.11 décrivent une communauté faunique très abondante et diversifiée visitant les fleurs de T. testudinum la nuit. L'eau de mer est presque 800 fois plus dense que l'air; Et de petits crustacés (0,6 8 mm de long, principalement 11. Ces visiteurs peuvent être un vecteur potentiel de transfert de pollen entre les fleurs et pour qu'un visiteur soit confirmé comme pollinisateur, les conditions suivantes devraient être démontrées12: (1) les organes masculins et féminins Sont visités, (2) le visiteur transporte le pollen, (3) le visiteur transfère le pollen entre les organes sexuels masculins et féminins, (4) le dépôt de pollen par le visiteur entraîne une fécondation réussie, estimée comme germination du pollen sur les stigmates, la croissance du tube pollen ou Nous avons testé ces quatre exigences pour confirmer si les invertébrés invités étaient des pollinisateurs sur T. testudinum dans trois configurations expérimentales différentes. Le principal défi de révéler si la faune pollinise potentiellement cette herbe marin exclut le transfert de pollen par l'eau. Nous l'avons atteint par Placer les fleurs et la faune dans de petits aquariums ou des mésocosmes sans écoulement de l'eau (Fig. 1 et 2 supplémentaires). Avant chaque essai, la faune a été capturée avec 1.6l pièges à lumière Ter coucher de soleil. La première mise en place a servi à observer les comportements de visitation de la faune et le dépôt de pollen sur les stigmates. Les fleurs mâles et femelles récemment détachées ont été placées à 2 3 cm d'écart dans un aquarium, et ont été filmées en absence ou en présence d'une faune abondante (densité500 personnes par litre). Le but d'un deuxième aquarium mis en place était de vérifier l'attrait des fleurs féminines en faune. Les visites aux fleurs féminines ont été enregistrées en vidéo, en absence ou en présence d'un mouvement de l'eau (généré avec deux petites têtes d'alimentation), avec une tache foliaire de T. testudinum comme substrat témoin. Une troisième mise en place a testé le succès de la pollinisation dans un cadre plus naturel dans les mésocosmes (100l) avec ou sans faune (densité 30 90 personnes par litre). Les fleurs mâles et femelles ont été placées entre 15 et 150 cm (correspondant à des distances dans un pré avec une floraison relativement abondante) pour déterminer si la proximité d'une fleur masculine était déterminante dans le succès de la pollinisation. Les fleurs étaient laissées dans le mésocosme pendant la nuit. Par la suite, les fleurs femelles ont été retirées et laissées dans un réservoir séparé pour permettre la croissance des tubes de pollen, qui ont été détectés dans des stigmates et des styles préservés sous un microscope fluorescent après coloration13. Avec cette preuve expérimentale, nous démontrons que les invertébrés marins sont des pollinisateurs de T. Testudinum. Ils visitent les fleurs féminines et mâles, transportent des grains de pollen sur leurs corps et transfèrent le pollen entre les fleurs masculines et féminines dans les expériences d'aquariums. Dans les mésocosmes, les grains de pollen transférés germent sur les stigmates et forment des tubes de pollen, ce qui indique une pollinisation réussie. Ainsi, T. testudinum a la pollinisation hydrophile et zoophile (transport par les animaux), en révoquant le paradigme que le pollen dans la mer n'est transporté que par l'eau. Les résultats des deux organes masculins et féminins sont visitésConfirmant le contact avec les organes reproducteurs des fleurs est la première étape Afin de prouver qu'un visiteur est un pollinisateur. Lors de la première mise en place expérimentale, en comparant le comportement de la faune sur les fleurs masculines et féminines dans les aquariums, nous avons identifié quatre types de comportement de visite: (1) toucher: la faune a touché les parties de la plante, le contact ayant seulement une fraction de seconde; (2) contact multiple: la faune a touché ces pièces au moins deux fois consécutivement; (3) visite: la faune s'est installée sur les parties; (4) alimentation: comportement indiquant l'alimentation; Soit en se déplaçant le long des parties de la plante, soit en présentant des mouvements abrupts de retraite. Les trois premiers types de comportement ont été observés sur les fleurs masculines et féminines; Cependant, la recherche de nourriture n'a été observée que sur les fleurs mâles (figure 1). Nous avons identifié des sphères dans le tube digestif de la zoea transparente (figure 2a). La forme et la taille de plusieurs sphères correspondaient à celle du pollen de T. testudinum, qui a été confirmée par la coloration histochimique avec l'auramine O (figure 3), car l'exine présente une fluorescence avec cette technique de coloration14. Les grains de pollen dans le tube digestif des larves de crustacés ont indiqué qu'ils ont ingéré la matrice de pollen mucilatérale. Le résultat de l'analyse du Chi a été: 2 = 26.99, df = 3, P0 (le nombre de visites de chaque type est indépendant du sexe de la fleur). Figure 2: Faune avec des grains de pollen. (A) Majid zoea larva (Stade I) avec un grain de pollen dans le tube digestif (les détails ont été obtenus avec un éclairage différent). (B) Thallasinidea zoea (stade I) avec un grain de pollen près de la tribune et de l'antenne. (C) Brachyuran zoea (stade I) avec un grain de pollen attaché à l'abdomen. (D) Jeune polychète de Syllid avec deux grains de pollen attachés à des segments; Le deuxième grain presque caché est indiqué par la flèche. Les grains de pollen sont indiqués par des cercles. Les barres représentent mm.Figure 3: Essais de vérification des grains de pollen de Thalassia testudinum (a, b). Le grain de pollen (indiqué par la flèche) dans le tube digestif d'un decapode zoea I (Brachyura),replique montre daytona, coloré avec de l'auramine O. Des images ont été prises avec un microscope confocal avec une longueur d'onde d'excitation de 405 nm et une longueur d'onde d'émission de 422 nm (la chitine de l'exosquelette de crustacés présente une fluorescence naturelle ). Dans l'image détaillée (b), l'ornementation microchimisée s'allume en points jaunes. (C) Pollen attaché à l'abdomen d'un crustacé teint avec de l'auramine O qui allume l'exine en jaune, sous microscope fluorescent. (D) Photo du grain de pollen avec un microscope électronique à balayage montrant l'ornementation microchimisée. Les barres représentent m.In la deuxième expérience d'aquarium, nous avons testé l'attrait des fleurs féminines en faune par rapport aux parties végétatives végétales. Bien que les fleurs et les pousses foliaires aient été visitées, il n'y avait aucune différence dans le nombre et le type de visite aux fleurs féminines et aux pousses foliaires en l'absence de mouvement de l'eau. Cependant, lors du mouvement de l'eau, les fleurs femelles ont été visitées plus fréquemment que les pousses foliaires (figure 4), ce qui indique que dans des conditions naturelles avec écoulement, ces fleurs peuvent effectivement capturer une petite faune. Les stigmates sont très collants, et les petits grains de sable in situ, les débris et la faune restent bloqués jusqu'à ce qu'ils soient balayés par le mouvement de l'eau (figure 3 supplémentaire). En l'absence de mouvement de l'eau, le résultat de l'analyse 2 était de 2 = 0,13, df = 2, P = 0,993; Ne pas rejeter H0 (Le nombre de visites de chaque type est indépendant de la partie de la plante). Avec le mouvement de l'eau, 2 = 9,26, df = 2, P = 0,001; Rejetant H0. Le visiteur transporte le pollenFauna capturé dans les pièges à lumière composé principalement de petits crustacés et polychètes (tableau complémentaire 1). Certains spécimens, recueillis après la fin des expériences de mésocosme, avaient une ou plusieurs sphères ressemblant au pollen attaché à leur corps. Les crustacés avaient des sphères sur les antennes, les parties buccales (maxillipèdes), les pereopodes ou l'abdomen (figure 2b, c), et les polychaètes avaient généralement beaucoup d'attache sur leurs segments ou leurs poils (chaeète, figure 2d). La coloration histochimique avec l'auramine O a confirmé que ces sphères étaient des grains de pollen (figure 3c). Le visiteur transfère le pollen entre les organes masculins et féminins. La déposition du pollen sur les stigmates par la faune a été démontrée dans les premiers aquariums expérimentaux mis en place en observant la faune sur un homme et Fleur femelle. Nous avons compté le nombre de grains de pollen sur les stigmates au début et après 15min. Lorsque nous avons entrepris nos observations, la plupart des fleurs féminines avaient déjà des grains attachés; Probablement déposé lors de la manipulation des fleurs. 5). Seule la faune aurait pu déplacer le pollen parce qu'il n'y avait pas d'eau dans les aquariums. Aucun grain de pollen n'a été gagné ou perdu sur les stigmates des fleurs féminines dans les traitements témoins sans faune (figure 5). Les barres horizontales sont la médiane, les cases montrent les 25e et 75e percentiles, et les moustaches indiquent la propagation. Aucun pollen n'a été ajouté ou éliminé dans des traitements de contrôle sans faune. Le pollen déposé entraîne une pollinisation réussie. Dans le troisième essai mis en place avec les mésocosmes, le pollen transporté par la faune a abouti à une pollinisation réussie, car la plupart des fleurs féminines ont présenté des tubes de pollen (figure 6; Figure 4 complémentaire). Les traitements de contrôle sans faune, en revanche,rolex daytona neuve replique, n'avaient que peu de tubes de pollen dans de rares occasions (figure 6). On s'attendait à ne trouver aucun tube de pollen dans les traitements de contrôle,replique cote rolex daytona, car les fleurs ont disparu après que nous les avons placées dans les mésocosmes; Cependant, ils auraient pu être issus de grains de pollen laissés dans les citernes ou introduits avec les pousses masculines nouvellement collectées, car certaines pousses masculines avaient une fleur qui avait ouvert la nuit précédente avec éventuellement des restes de pollen et 1% de grains de pollen Est toujours viable après 24h (réf. 10). Mais le nombre de tubes de pollen sur les fleurs de contrôle était toujours minime, et il était significativement différent du nombre sur les fleurs femelles en présence de la faune (2 38.75, df 4, P2 10.465, df 15, P> 0.90; Fig. 6 ), Ce qui suggère que la faune peut transporter le pollen sur des distances relativement importantes. Les fleurs mâles et femelles ont été séparées par une gamme de distances de 15 à 150 cm.Discussion Dans cette étude, nous montrons que la faune invertébrée visitant la prairie marquée T. testudinum est conforme aux quatre conditions préalables pour être considérées comme des pollinisateurs. Le processus de pollinisation implique la faune à la dérive qui s'approche de la masse de pollen de mucilage des fleurs mâles. Les forages de la faune sur cette masse, et certains grains de pollen restent attachés à leurs parties du corps en raison de la nature collante du mucilage. La faune retirée de la fleur par le mouvement de l'eau est ensuite capturée par le tentacule comme des stigmates des fleurs féminines, et des grains de pollen sont déposés pour ensuite germer, formant des tubes de pollen. Le mucilage des fleurs mâles forme un nuage lors de la dissolution dans l'eau, augmente la viscosité de l'eau et diminue la vitesse d'écoulement15; Contribuant ainsi à l'approche de la faune. La masse de pollen de mucilage est une récompense alimentaire probable pour les pollinisateurs, en échange de services de dispersion de pollen similaires à de nombreuses plantes terrestres16. Le tentacule, comme la stigmate et les bractées des fleurs féminines, modifie les schémas d'écoulement de l'eau facilitant la capture du pollen1 et de la faune, qui subsistent ensuite dans la stigmate. La pollinisation se produit également en l'absence de mouvement de l'eau dans les mésocosmes, ce qui suggère que la faune peut se déplacer activement vers les fleurs masculines et féminines en l'absence de flux, peut-être en recherche de substrat pour le colonisation ou entraîné par la chimiotaxie (mouvement entraîné par un stimulus chimique ) 17.Nous rejetons pas l'eau comme vecteur principal pour le transport de pollen dans cette espèce de graminée. Mais similaire à de nombreuses plantes terrestres pollinisées par le vent qui ont des traits partagés avec des plantes pollinisées par des insectes18, T. testudinum a probablement un syndrome de pollinisation mixte: hydrophile et 'zoobenthophilé'. La Zoobenthophylie est un nouveau type de pollinisation dérivée du benthos (communauté d'organismes qui vivent à proximité ou à proximité du fond de la mer), car la pollinisation se produit près des fonds marins et de nombreux invertébrés appartiennent au zoo benthos; Bien que zoea soit une natation gratuite ou un flottement libre19, et se produisent à la fois dans la zone benthique et planctonique. De nombreuses caractéristiques du syndrome de pollinisation zoobenthophilique coïncident avec celle de l'hydrophie; Tels que la libération de pollen en abondante mucilage et tentacule comme la stigmate. Cependant, semblable à la floraison nocturne des plantes associées à la pollinisation par les chauves-souris, les coléoptères ou les mites20,21, nous prévoyons que la libération de pollen nocturne est un trait du syndrome de pollinisation zoobenthophilée. Beaucoup de petits invertébrés pollinisants se cachent dans les sédiments et dans le couvert végétal pendant la journée et deviennent actifs à la nuit22,23. On sait très peu de choses sur le moment de la libération de pollen dans les grappes marines, et les seuls enregistrements d'autres espèces de graines de seagrès avec ouverture nocturne de fleurs mâles (dans les aquariums) concernent Halophila hawaiiana24.Zoobenthophily favorise vraisemblablement le succès reproductif de la graine de terre T. testudinum. Il peut s'agir d'un mécanisme d'assurance reproductive en l'absence de mouvement de l'eau (bien que cela ne soit pas rare dans le milieu marin), et cela étend probablement la plage de pollinisation à l'eau qui est limitée25. À des distances> 20 cm entre fleurs mâles et femelles, la probabilité de fertilisation diminue déjà26. Les invertébrés marins avec la locomotion semi-active27 peuvent parcourir beaucoup plus loin, ce qui pourrait étendre la gamme de dispersion du pollen. Ceci est confirmé par nos résultats de l'expérience du mésocosme avec la faune, où la distance entre les fleurs mâle et femelle (15 150 cm) n'a eu aucun effet sur le nombre de tubes de pollen développés. Dans ce contexte, il est important de mentionner que nos pièges à lumière n'ont capturé que les plus petits invertébrés, car les plus grands échappaient habituellement aux pièges. Les conséquences négatives de la consommation de grains de pollen par la faune des invertébrés sont négligeables, car seule une très petite fraction des 1.6 105 grains de pollen par fleur est consommée. La contribution réelle de la zoobenthophilie par rapport à l'hydrophie dans le succès de la pollinisation de cette herbe marin n'a pas encore été établie dans la mer et dépendra probablement de paramètres environnementaux. La migration par écoulement d'eau est rare et la plupart des plantes aquatiques d'eau douce ont des fleurs qui apparaissent dans la Air28. Les angiospermes marins ont probablement évolué chez les ancêtres d'eau douce1,3,29, et les Hydrocharitaceae (la famille de T. testudinum) étaient susceptibles d'être pollinisées par des insectes28. La pollinisation abiotique terrestre se produit habituellement par le vent, qui a probablement évolué à partir de la pollinisation des insectes en réponse aux limitations des pollinisateurs et aux changements dans l'environnement abiotique18. À l'instar de la pollinisation des insectes, la pollinisation par la faune marine des invertébrés peut avoir joué un rôle dans la transition de la pollinisation sous-marine terrestre à abiotique par le flux d'eau. Cependant, les herbiers sont polyphylétiques30 et la transition entre l'eau douce et le milieu marin peut différer entre les lignées. D'autres recherches sur l'écologie de la reproduction de ce groupe de plantes peuvent révéler si le syndrome de pollinisation biologique abiotique mixte survient plus fréquemment dans le milieu marin. Méthodes de collecte des fleursLes expériences ont été réalisées du 20 au 24 avril 2014 et du 13 au 14 mai 2016. À midi, Avant les expériences, les taches foliares de T. testudinum avec des bourgeons fermés de mâle ou de femelle ont été recueillies dans différents sites avec une floraison abondante dans la lagune de récif de Puerto Morelos, au Mexique. Seuls les bourgeons dépassant le niveau des sédiments ayant un pédicelle étiré ont été sélectionnés, car ils devaient s'ouvrir le même soir10. Les pousses foliaires avec les bourgeons pour les expériences d'aquarium, ont été coupées avec un couteau au-dessous du substratum, et elles ont été conservées séparément dans des réservoirs d'eau de mer fermés jusqu'à leur utilisation. Les fleurs pour les expériences de mésocosmes ont été échantillonnées avec un corbeau de PVC (diamètre 4,3 cm, profondeur de 15 cm), pour collecter un tour de floraison entier avec un petit gazon de sédiments.Collection de la faune La faune des invertébrés a été collectée immédiatement avant chaque expérience. La collecte a eu lieu après le coucher du soleil (après 20h30 heure locale DLS), dans des pièges à la maison de 1.6l de flacons en plastique transparent, avec entrée inversée, attachés à une tige avec une lampe de plongée. La lumière de la lampe de plongée a attiré la faune, et les pièges ont été laissés à 30 40 mille au-dessus d'une prairie proche de la prairie. Cette prairie n'avait aucune ou très peu de fleurs pour éviter de collecter la faune avec le pollen attaché autant que possible.Aquarium experimental 1T. Les fleurs et la faune testudinum ont été observées dans de petits aquariums placés dans le noir. L'eau de mer avec la faune d'un piège a été très soigneusement versée dans les aquariums (Supplément Fig. 1) et remplie d'eau de mer supplémentaire jusqu'à 3l. La densité des organismes dans les aquariums était de 500 individusS par litre; La majorité étant un petit cru