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Signalisation et extinction de la quorum de la communauté
La communauté des boues floculaires a montré un taux élevé d'activité QQ, et ce taux dépendait de la longueur de la chaîne acyle démontrant la spécificité de la dégradation. Lorsque la biomasse flocculaire a été transformée en boues granulaires, l'activité QQ de la communauté a été réduite de 30%. N-acyl homosérine lactones avec quatre à huit atomes de carbone sur la chaîne acyl accumulée au stade granulaire, et leurs concentrations étaient au moins trois fois supérieures à celles du stade floculaire. Ces résultats ont corroboré l'analyse de la méta-communauté où un changement majeur dans les espèces dominantes des inhibiteurs potentiels des signaux aux producteurs a été observé lors de la transition des flocons aux granulés, indiquant le rôle de la composition des espèces et les activités de signalisation associées dans la coordination des comportements communautaires.
Conclusions: Cette étude suggère que QQ a une fonction importante dans la régulation de la signalisation QS au niveau communautaire et fournit un aperçu mécaniste du rôle de la biologie QS dans l'assemblage communautaire complexe.
Introduction Dans la plupart des écosystèmes naturels et artificiels, les bactéries résident principalement dans des communautés structurées, dans des agrégations communément appelées biofilms microbiens.1 Ces consortiums microbiens peuvent être composés de centaines à milliers d'espèces bactériennes avec des capacités métaboliques variables et affichant collectivement des propriétés au niveau communautaire distinctes de Les cellules planctoniques.2,3 La composition générale et la fonction des biofilms complexes sont généralement influencées par les interactions entre les différentes espèces microbiennes.1,3 La compréhension de la dynamique des interactions interspécifiques au sein de ces biofilms multi-espèces complexes est un défi, mais important pour contrôler Et réguler les fonctions clés de l'écosystème. Diversité des bactéries produisant et dégradant de la N-acyl homosérine lactone dans les sols et la rhizosphère du tabac. Environ Microbiol 2005; 7: 1796 1808. Promotion de la croissance des bactéries de trempe de quorum dans la rhizosphère de Solanum tuberosum. Environ Microbiol 2007; 9: 1511 1522. Le dialyse à médiation par acyl homosérine lactone parmi les bactéries épiphytes module le comportement de Pseudomonas syringae sur les feuilles. ISME J 2009; 3: 825 834. Partage des signaux de détection du quorum et du rôle des communautés interspécifiques dans une maladie bactérienne des plantes. ISME J 2011; 5 Par exemple, Burkholderia cepacia peut percevoir les AHL libérées par Pseudomonas aeruginosa en co culture, conduisant à la formation de microcolonies mixtes, contrairement à la formation de microcolonies séparées et non mixtes En l'absence d'activité QS.10 Les AHL sont également présents à des concentrations biologiquement pertinentes dans des communautés complexes dans une large gamme d'habitats, y compris les expectorations de patients atteints de fibrose kystique, 13 tapis microbiens, 14 le rumen 15 et les stations de traitement des eaux usées16,17. Les résultats suggèrent que la signalisation QS au niveau communautaire est susceptible d'être importante dans la plupart des habitats. En effet, le rôle du QS médié par l'AHL dans la formation de biofilms complexes de boues d'espèces mixtes ainsi que l'assemblage de granules microbiens a récemment été démontré dans un bioréacteur à membrane18 et Un réacteur discontinu séquentiel (SBR), 19 respectivement. Pour le SBR, on a constaté que la production in situ d'AHL spécifiques était forte et positive c Ou liés à la morphogenèse des granules microbiens. Des concentrations élevées d'AHL ont été liées à la formation de granulés, alors que les concentrations diminuées ont coïncidé avec la désintégration des granulés et la conversion aux flocs.19 Plus important encore, ces processus étaient étroitement liés à l'abondance d'une gamme diversifiée d'espèces microbiennes dans les communautés granulaires , Ce qui suggère une interaction communautaire hautement complexe fondée sur la base de l'AHL19. Cependant, il n'est pas clair comment de telles interactions peuvent être réalisées et coordonnées entre les individus, les espèces phylogénétiquement différentes, dans les communautés complexes.
Un mécanisme possible pour la régulation du comportement QS dans l'environnement est le contrôle des concentrations de signal,rolex day date or rose replique, ce qui est essentiel pour une signalisation QS efficace. Il est possible que la concentration du signal dans l'environnement puisse être régulée par une activité spécifique de dégradation du signal enzymatique ou une extinction du quorum (QQ) par les membres de la communauté. L'acyl homosérine lactone acylase de Ralstonia XJ12B représente une classe nouvelle et puissante d'enzymes de trempe de quorum. Mol Microbiol 2003; 47: 849 860. Identification d'une N-acylhomoserine lactone acylase extracellulaire à partir d'une Streptomyces sp. Et son application à la trempe de quorum. Appl Environ Microbiol 2005; 71: 2632 2641. L'enzyme codée par Rhodococcus qsdA définit une nouvelle classe de lactonases de trempe de quorum à grand spectre. Appl Environ Microbiol 2008; Le rôle écologique et l'impact de QQ sur la signalisation QS restent largement inconnus. Nous avons exploré le rôle de QQ en tant que régulateur ou modulateur de la signalisation QS de la communauté. En utilisant un complexe Le QQ dépend de l'AHL a été jugé actif et spécifique, médié par des membres de la communauté d'origines diverses. L'assemblage de la biomasse flocculaire dans les biofilms des boues granulaires était inversement corrélé avec les activités QS et QQ concurrentes de la communauté, Ce qui suggère une fonction importante de QQ dans la coordination de la signalisation et du comportement QS au niveau communautaire.
Matériaux et méthodes Opérations du secteur automobile Une SBR (1076,4 cm, diamètreheight), ensemencée avec une communauté de boues floculaires d'une usine de récupération d'eau (Ulu Pandan, Singapour), a été exploitée à 22 ° C pendant 82 semaines24. La culture des boues a été alimentée en eaux usées synthétiques (SWW) 150mg de demande d'oxygène chimique par litre d'acétate et 50mg de demande d'oxygène chimique par propionate de litre comme source de carbone, 20mg / l d'ammonium, 10mg / l d'orthophosphate et éléments nutritifs traces.25 Le bioréacteur avait un volume de travail final de 4l. L'opération du bioréacteur impliquait un cycle de 5 h avec deux étapes continues de périodes anaérobies, aérobies et anoxiques. Un volume total de 1 litre SWW a été alimenté par cycle et a entraîné un temps de rétention hydraulique de 20h. Le pH du bioréacteur a été maintenu entre 6,7 et 8,2 sous le contrôle d'un contrôleur logique programmable via un dosage de 9,12 g / l de HCl ou 10,0 g / l de NaOH. La performance du système du bioréacteur a été surveillée par des études de cycle hebdomadaires. La biomasse des boues a été immédiatement récoltée après centrifugation (5min, 8000g, 4C) et stockée à 80 ° C pour une analyse ultérieure de l'ARN. De même, des aliquotes de 50 ml d'effluents traités ont été conservées à 80 ° C immédiatement après l'échantillonnage pour une analyse plus tard de l'AHL. Aux semaines 40 44, une partie de la culture de boues floculaires du SBR a été recueillie et utilisé pour semer une seconde SBR (6200 cm de diamètre). Le second SBR a fonctionné selon le premier SBR, avec quelques modifications, pour faciliter la formation de granulés microbiens (comme décrit précédemment en détail) .19 En bref, le second SBR a fonctionné à un temps de rétention hydraulique de 12h et le temps de décantation pour Chaque cycle a été réduit de 60 à 5 min dans les 5 premières semaines de fonctionnement du réacteur.19 Les granulés ont donc été définis comme des agrégats compacts avec un diamètre de particule minimal de 100 m et un indice volumétrique des boues (SVI5, une mesure de la densité / compacité de la biomasse) de 50 ml / G ou moins, 19,27 tandis que les flocons étaient une biomasse partiellement agrégée avec un diamètre de particule de 100 m ou moins et un SVI5 d'au moins 50 ml / g.
Souches bactériennes et conditions de croissance Les biosensors AHL incluant Agrobacterium tumefaciens A136,28 Chromobacterium violaceum CV026 (réf. 29) et Escherichia coli pJBA357,30 ainsi que P. aeruginosa MH602 (réf. 31) et E. coli JM109 (réf. 32) étaient de routine Maintenu dans Luria Bertani moyen. Les antibiotiques suivants ont été complétés dans le milieu de croissance chaque fois que nécessaire: tétracycline (4,5 g / ml), spectinomycine (50 g / ml), kanamycine (50 g / ml), ampicilline (100 g / ml) ou gentamycine (40 g / ml). Les génotypes de ces souches bactériennes sont énumérés dans le tableau complémentaire S1. Des échantillons ont été prélevés de chaque microcosme à différents moments, et la biomasse des boues a été éliminée par centrifugation (10min, 8000 g). Les AHL résiduels dans le surnageant de boues ont été extraites et quantifiées par spectromètre de masse tandem en chromatographie liquide à haute performance (Shimadzu, Singapour) comme décrit ci-dessous. Les boues inactivées par la chaleur et les contrôles SWW ont été inclus. L'adsorption des AHL à la biomasse des boues a été déterminée en comparant les AHL résiduelles dans le SWW et les contrôles des boues inactivées par la chaleur, immédiatement après l'addition, ainsi qu'après 1 heure d'incubation. Le pH de chaque microcosme de boues (liquide en vrac) a été surveillé tout au long de l'étude et a varié entre 6,7 et 6,9. L'impact du pH sur l'intégrité des AHL a également été évalué en ajoutant des AHL synthétiques à SWW tamponnés à différentes valeurs de pH allant de 6,7 à 8,3. Les courbes de régression linéaires et non linéaires ont été modélisées à l'aide de Prism (GraphPad, San Diego,replique rolex oyster perpetual or, CA, USA). La demi-vie du signal a été estimée en fonction de la cinétique zéro et du premier ordre.33
Détection et quantification des AHL par spectrométrie de masse tandem en chromatographie liquide à haute performance (LC MS / MS) La détection et la quantification des AHL provenant des effluents traités par les bioréacteurs ou des surnageants de boues ont été menées comme décrit par Tan et al.19 En bref, les AHL ont été extraits et concentrés à partir des Surnageants en utilisant du dichlorométhane (Sigma Aldrich). Les extraits de dichlorométhane ont été analysés et quantifiés à l'aide d'un spectromètre de masse tandem en chromatographie liquide à haute performance (Shimadzu LCMS8030, Shimadzu). Tous les échantillons ont été chromatographiés par chromatographie liquide à haute performance (colonne Shim pack XR ODS C18) à un débit de 0,3 ml / min. La phase mobile consistait en un gradient linéaire (40 95%) du solvant B (méthanol avec 0,1% d'acide formique) et du solvant A (formiate d'ammonium 25 mM avec 0,1% d'acide formique). Les effluents ont été ionisés par ionisation par électrospray en mode positif et détectés à l'aide de l'approche de la surveillance de la réaction multiple.14,34 Des expériences de surveillance de réaction multiple associées à la matrice ont été menées pour toutes les AHL.19 Chaque profil de surveillance de la réaction multiple standard, y compris le temps de rétention de la chromatographie liquide spécifique (LC) , L'apparition de l'ion précurseur m / z et deux ions de transition, ainsi que l'intensité relative des deux ions de transition, a été utilisée comme référence. Pour confirmer l'identité des AHL putatives, un balayage complet allant de m / z 100 à 350, couplé au mode de balayage ionique précurseur, a été effectué par rapport aux AHL standard.14 Pour la quantification AHL, des courbes standard matricielles allant de 0,5 À 200g / l, ont été construits. Deux ions de transition, caractéristique des AHL respectifs, ont été utilisés pour identifier l'AHL, et l'ion de transition avec la plus haute intensité a été utilisé pour construire les courbes standard. Les zones de pointe de l'analyte ont été intégrées à l'aide de LabSolutions (Shimadzu). Les limites de détection et de quantification pour chaque AHL ont été calculées avec un rapport signal / bruit de 3,3 et 10 respectivement14. La quantité de chaque AHL putative dans l'échantillon a été calculée en fonction de la courbe standard et de l'efficacité d'extraction de l'AHL respectif. L'efficacité d'extraction pour chaque AHL a été calculée en fonction de la récupération des AHL standard ajoutés à 5 et 50 g / l à la matrice d'échantillon surnageant de boues inactivées par la chaleur. Des injections vierges ont été effectuées aux intervalles d'injection d'échantillons pour éviter le report de l'échantillon.
Isolation des membres de la communauté des boues Au total, cinq expériences indépendantes d'isolement ont été réalisées à partir des semaines 40 à 44 de l'opération du bioréacteur. Chaque fois, 20 ml d'échantillons de boues uniformément mélangées ont été prélevés sur le bioréacteur à la fin d'un cycle opérationnel. Les échantillons de boues ont été vortexés vigoureusement pendant 5 minutes pour disperser les cellules floculaires, dilués en série et étalés sur les milieux de culture suivants: bouillon nutritif, R2A, isolation de Pseudomonas, SWW et ABT35 supplémentés avec 1,5% (p / v) d'agar chacun. Les plaques ont été incubées à 22 ° C pendant 5 jours. Le test biologique Tumefaciens A136, l'agar-indicateur ABT agar35 avec 50 g / ml de 5 bromo 4 chloro 3 indolyl b D galactopyranoside (X gal) a été préparé, tandis que la gélose Luria Bertani a été utilisée pour l'essai biologique CV026 de C. violaceum. Dix microlitres de cultures nocturnes de biosensors ont été repérés sur les plaques indicatrices, tandis que 10 l de cultures d'isolats d'une nuit ont été placés à 5 mm de l'endroit du biocapteur et incubés à 30 ° C pendant 48 heures. Les AHL produites in situ ont été détectées à l'aide du biosensor E. coli JBA357. En bref, 100l de 5 E. dilué pendant 4 h avant l'examen par microscope à balayage laser confocal (Zeiss LSM 710, Carl Zeiss Pte. Ltd., Singapour) à une longueur d'onde d'excitation / émission de 488/522 535 nm. E. coli JM109, P. aeruginosa MH602 et AHL synthétiques ont été inclus comme témoins. Pour 2h. Après la centrifugation et la stérilisation ultraviolette, les AHL résiduels ont été quantifiés à l'aide de l'essai biologique A. tumefaciens A136.38,39 En bref, six barres d'agar de 1 cm chacune ont été sécréties de manière aseptique à partir des plaques témoins ABT. Cinq microlitres d'échantillons ont été repérés à une extrémité des barres d'agar. Environ 0,5l de culture de nuit de A. tumefaciens A136 a été repéré progressivement à d'autres distances des échantillons chargés. Les plaques ont été incubées à 30 ° C pendant 24h. Les AHL ont été ajoutés à Luria Bertani à pH 6,7, 7,2 et 10,2, et les cultures de E. coli JM109 ont été incluses comme témoins. Le pH de toutes les cultures de nuit a été déterminé pour être l'analyse de séquençage d'ARN. L'ARN total a été extrait de boues en utilisant FastRNA Pro Soil Direct kit (MP Biomedicals, Singapour) selon les directives du fabricant. L'ARN extrait a été soumis à un prélèvement d'ADN en utilisant le kit TURBO DNA free (Applied Biosystems). L'ARN total, 200 nd, a été utilisé pour la préparation complémentaire de la bibliothèque d'ADN selon les instructions du fabricant (Illumina, Singapour). Chaque bibliothèque d'ADN complémentaire a été ligaturée avec une séquence d'adaptateur unique pour le multiplexage d'échantillon. Au total, 16 bibliothèques d'ADN complémentaires différentes ont été regroupées et séquencées par MiSeq System (Illumina). Les données de séquençage de l'ARN ont été analysées à l'aide d'une méthode à balise rapide comme décrit.19 En bref, une amorce universelle (5 CGACRRCCATGCANCACCT 3) pour la région hypervariable 16S rARN (V6) a été utilisée pour analyser chaque séquence de lecture pour obtenir les 33 séquences d'étiquettes nucléotidiques en aval De l'amorce, et les 33 séquences nucléotidiques sont définies comme la marque V6 du gène 16S rRNA. L'amorce universelle correspond à 94% des séquences d'ARNr 16S dans la base de données RDP.41 Pour éliminer les marques V6 dérivées d'erreur de séquençage, seules les balises V6 qui ont été observées dans au moins deux lectures différentes ont été conservées pour analyse. En outre, les étiquettes V6 ont été supprimées lorsqu'un seul type de lecture séquentielle représentait 50% de toutes les lectures couvrant cette étiquette V6. Cela a été fait pour éliminer les artefacts de séquençage où des lectures doubles identiques ont été générées à partir de modèles uniques. Les tests de comparaison multiple de Holm Sidak ont été effectués pour comparer les demi-vies d'AHL dans différents échantillons ou pour examiner l'expression de l'AHL entre différents échantillons de boues. Les coefficients de corrélation de Pearson ont été déterminés et de fausses corrections de taux de découverte ont été faites pour toutes les corrélations multiples. Ont été regroupés en utilisant une méthode de clustering hiérarchique non supervisée basée sur la distance Euclidienne avec une liaison complète codée par Cluster 3.0 et visualisée à l'aide de Java TreeView (Open Source Clustering Software, Tokyo, Japon).
Résultats La communauté de boues floculaires dégrade les AHL différentiellement en fonction de la longueur de la chaîne acylique. Un bioréacteur communautaire hautement diversifié de boues floculaires subissant une nitrification simultanée, une dénitrification et une élimination du phosphore a été utilisé comme système expérimental (figure supplémentaire S1). Pour déterminer si l'activité QQ spécifique de l'AHL était présente dans ce système modèle, les AHL synthétiques ont été ajoutés individuellement ou en mélange aux boues floculaires pour caractériser les taux de dégradation du signal. Environ 10 30% des AHL ont été perdus en raison de l'adsorption à la biomasse, tandis que la perte des 70 90% restants du signal a été attribuée à l'activité biologique (Figure supplémentaire S2). Ceci était évident par les demi-vies AHL sensiblement plus courtes en présence de boues vivantes que lorsqu'elles étaient incubées en présence de boues inactivées par la chaleur (PFigure 1). En présence de boues vivantes, la demi-vie du signal était inversement proportionnelle à la longueur de la chaîne acylique, indépendamment de la substitution en position C3 (Figure 1). Par exemple, la demi-vie pour les signaux à chaîne courte C6 HSL et 3OC6 HSL était respectivement de 1.950.45 et 2.570.29h, alors que les demi-vies des signaux à chaîne longue C12 HSL et 3OC12 HSL étaient considérablement plus courtes à 0.790.08 et 0.660. 06h, respectivement. Le pH du microcosme des boues vivantes était cohérent à 6,7 6,9 et les données pour les contrôles tampons SWW indiquaient qu'il y avait une faible dégradation spontanée des AHL entre des valeurs de pH de 6,7 8,3 (figure supplémentaire S3). Par conséquent, il est probable que la perte d'AHL observée ici est due à une digestion enzymatique active plutôt qu'à une dégradation chimique passive.
Figure 1 Dégradation des lactosacérases d'homosérine N (AHL) en fonction de la fonction de la longueur de chaîne acyl dans les boues floculaires. La valeur de dégradation est exprimée en demi-vie de signal. Un mélange d'acides gras non substitués (a) et oxo-substitués (b) a été ajouté aux boues vivantes (cercle ouvert) ou à la chaleur inactivée (cercle solide) à une concentration finale de 5 M pour chaque AHL. Le pH de chaque mélange de boues (liquide en vrac) a été surveillé tout au long de l'étude et variait entre pH 6,7 et 6,9. Les AHL résiduelles ont été extraites et quantifiées à l'aide de LC MS / MS à différents moments. La demi-vie du signal pour chaque AHL a été estimée en fonction de la cinétique de l'ordre zéro ou du premier ordre. (N = 3, répliques biologiques). Des tests t multiples de Holm Sidak ont été effectués (contrôle inactivé en fonction de la durée de vie par rapport à la chaleur pour chaque AHL) et des valeurs de P corrigées (P
Une proportion significative des membres de la communauté des boues floculaires produisent ou calment les AHL afin de mieux comprendre les relations entre la spécificité de l'activité QQ et la production de signal dans la communauté des boues floculaires, 307 souches de bactéries et 23 souches de champignons, correspondant à 50 bactéries Et quatre genres fongiques ont été isolés et testés pour leur capacité à produire ou à dégrader les AHL (Tableau supplémentaire S2). Les isolats bactériens représentaient 3,5% des membres de la communauté totale identifiés par séquençage de l'ARN (tableaux supplémentaires S3 et 4). La production d'AHL a été principalement évaluée en fonction de l'activation de différents biosensors, y compris E. coli JBA357,30 A. tumefaciens A13628 et C. violaceum CV026.29 Le profil AHL de chaque producteur de signal putatif a ensuite été déterminé en utilisant LC MS / MS. La dégradation de l'AHL a été testée en utilisant des AHL avec des chaînes acyle courtes (3OC6 HSL), moyenne (3OC8 HSL) et lonely (3OC12 HSL). Une grande proportion d'isolats de boues floculaires, soit 65%, étaient des producteurs de signaux AHL ou des extincteurs (figure 2). Bien que seulement 10% des isolats puissent produire des AHL, jusqu'à 58,1% des isolats ont réussi à étancher au moins une des AHL examinées. Une proportion relativement faible des isolats,rolex oyster femme contrefaçon, de 4,8%, a produit et désactivé des AHL. Les 36,7% restants des isolats n'ont ni produit ni désactivé les AHL. Tous les extincteurs AHL étaient capables d'inactiver l'AHL à longue chaîne, 3OC12 HSL. Bien que 77% des extincteurs n'aient pu que dégrader les AHL à longue chaîne, 23% pourraient dégrader les AHL à longue chaîne ainsi que les AHL à chaîne courte ou moyenne.
Figure 2Distribution des isolats en fonction de leur capacité à produire et / ou énerrer les lactones homosérine N acyl (AHL). Au total, 330 isolats, dont 307 et 23 souches d'origine bactérienne et fongique,rolex datejust 2 fond noir faux, ont été cultivés à partir de la communauté des boues floculaires pendant l'opération du bioréacteur à partir des semaines 40 44. Tous les isolats ont été criblés pour la production d'AHL par différents bilans biologiques et LC MS / MS , Ainsi que pour leur capacité à étancher 5M d'AHL avec des chaînes d'acyle courtes (3OC6 HSL), moyennes (3OC8 HSL) et longue (3OC12 HSL) après 2h d'incubation. Les AHL résiduels ont été quantifiés à l'aide de l'essai biologique à base d'agar A. tumefaciens A136.Les membres de la communauté AHL qui trempe sont p
La communauté des boues floculaires a montré un taux élevé d'activité QQ, et ce taux dépendait de la longueur de la chaîne acyle démontrant la spécificité de la dégradation. Lorsque la biomasse flocculaire a été transformée en boues granulaires, l'activité QQ de la communauté a été réduite de 30%. N-acyl homosérine lactones avec quatre à huit atomes de carbone sur la chaîne acyl accumulée au stade granulaire, et leurs concentrations étaient au moins trois fois supérieures à celles du stade floculaire. Ces résultats ont corroboré l'analyse de la méta-communauté où un changement majeur dans les espèces dominantes des inhibiteurs potentiels des signaux aux producteurs a été observé lors de la transition des flocons aux granulés, indiquant le rôle de la composition des espèces et les activités de signalisation associées dans la coordination des comportements communautaires.
Conclusions: Cette étude suggère que QQ a une fonction importante dans la régulation de la signalisation QS au niveau communautaire et fournit un aperçu mécaniste du rôle de la biologie QS dans l'assemblage communautaire complexe.
Introduction Dans la plupart des écosystèmes naturels et artificiels, les bactéries résident principalement dans des communautés structurées, dans des agrégations communément appelées biofilms microbiens.1 Ces consortiums microbiens peuvent être composés de centaines à milliers d'espèces bactériennes avec des capacités métaboliques variables et affichant collectivement des propriétés au niveau communautaire distinctes de Les cellules planctoniques.2,3 La composition générale et la fonction des biofilms complexes sont généralement influencées par les interactions entre les différentes espèces microbiennes.1,3 La compréhension de la dynamique des interactions interspécifiques au sein de ces biofilms multi-espèces complexes est un défi, mais important pour contrôler Et réguler les fonctions clés de l'écosystème. Diversité des bactéries produisant et dégradant de la N-acyl homosérine lactone dans les sols et la rhizosphère du tabac. Environ Microbiol 2005; 7: 1796 1808. Promotion de la croissance des bactéries de trempe de quorum dans la rhizosphère de Solanum tuberosum. Environ Microbiol 2007; 9: 1511 1522. Le dialyse à médiation par acyl homosérine lactone parmi les bactéries épiphytes module le comportement de Pseudomonas syringae sur les feuilles. ISME J 2009; 3: 825 834. Partage des signaux de détection du quorum et du rôle des communautés interspécifiques dans une maladie bactérienne des plantes. ISME J 2011; 5 Par exemple, Burkholderia cepacia peut percevoir les AHL libérées par Pseudomonas aeruginosa en co culture, conduisant à la formation de microcolonies mixtes, contrairement à la formation de microcolonies séparées et non mixtes En l'absence d'activité QS.10 Les AHL sont également présents à des concentrations biologiquement pertinentes dans des communautés complexes dans une large gamme d'habitats, y compris les expectorations de patients atteints de fibrose kystique, 13 tapis microbiens, 14 le rumen 15 et les stations de traitement des eaux usées16,17. Les résultats suggèrent que la signalisation QS au niveau communautaire est susceptible d'être importante dans la plupart des habitats. En effet, le rôle du QS médié par l'AHL dans la formation de biofilms complexes de boues d'espèces mixtes ainsi que l'assemblage de granules microbiens a récemment été démontré dans un bioréacteur à membrane18 et Un réacteur discontinu séquentiel (SBR), 19 respectivement. Pour le SBR, on a constaté que la production in situ d'AHL spécifiques était forte et positive c Ou liés à la morphogenèse des granules microbiens. Des concentrations élevées d'AHL ont été liées à la formation de granulés, alors que les concentrations diminuées ont coïncidé avec la désintégration des granulés et la conversion aux flocs.19 Plus important encore, ces processus étaient étroitement liés à l'abondance d'une gamme diversifiée d'espèces microbiennes dans les communautés granulaires , Ce qui suggère une interaction communautaire hautement complexe fondée sur la base de l'AHL19. Cependant, il n'est pas clair comment de telles interactions peuvent être réalisées et coordonnées entre les individus, les espèces phylogénétiquement différentes, dans les communautés complexes.
Un mécanisme possible pour la régulation du comportement QS dans l'environnement est le contrôle des concentrations de signal,rolex day date or rose replique, ce qui est essentiel pour une signalisation QS efficace. Il est possible que la concentration du signal dans l'environnement puisse être régulée par une activité spécifique de dégradation du signal enzymatique ou une extinction du quorum (QQ) par les membres de la communauté. L'acyl homosérine lactone acylase de Ralstonia XJ12B représente une classe nouvelle et puissante d'enzymes de trempe de quorum. Mol Microbiol 2003; 47: 849 860. Identification d'une N-acylhomoserine lactone acylase extracellulaire à partir d'une Streptomyces sp. Et son application à la trempe de quorum. Appl Environ Microbiol 2005; 71: 2632 2641. L'enzyme codée par Rhodococcus qsdA définit une nouvelle classe de lactonases de trempe de quorum à grand spectre. Appl Environ Microbiol 2008; Le rôle écologique et l'impact de QQ sur la signalisation QS restent largement inconnus. Nous avons exploré le rôle de QQ en tant que régulateur ou modulateur de la signalisation QS de la communauté. En utilisant un complexe Le QQ dépend de l'AHL a été jugé actif et spécifique, médié par des membres de la communauté d'origines diverses. L'assemblage de la biomasse flocculaire dans les biofilms des boues granulaires était inversement corrélé avec les activités QS et QQ concurrentes de la communauté, Ce qui suggère une fonction importante de QQ dans la coordination de la signalisation et du comportement QS au niveau communautaire.
Matériaux et méthodes Opérations du secteur automobile Une SBR (1076,4 cm, diamètreheight), ensemencée avec une communauté de boues floculaires d'une usine de récupération d'eau (Ulu Pandan, Singapour), a été exploitée à 22 ° C pendant 82 semaines24. La culture des boues a été alimentée en eaux usées synthétiques (SWW) 150mg de demande d'oxygène chimique par litre d'acétate et 50mg de demande d'oxygène chimique par propionate de litre comme source de carbone, 20mg / l d'ammonium, 10mg / l d'orthophosphate et éléments nutritifs traces.25 Le bioréacteur avait un volume de travail final de 4l. L'opération du bioréacteur impliquait un cycle de 5 h avec deux étapes continues de périodes anaérobies, aérobies et anoxiques. Un volume total de 1 litre SWW a été alimenté par cycle et a entraîné un temps de rétention hydraulique de 20h. Le pH du bioréacteur a été maintenu entre 6,7 et 8,2 sous le contrôle d'un contrôleur logique programmable via un dosage de 9,12 g / l de HCl ou 10,0 g / l de NaOH. La performance du système du bioréacteur a été surveillée par des études de cycle hebdomadaires. La biomasse des boues a été immédiatement récoltée après centrifugation (5min, 8000g, 4C) et stockée à 80 ° C pour une analyse ultérieure de l'ARN. De même, des aliquotes de 50 ml d'effluents traités ont été conservées à 80 ° C immédiatement après l'échantillonnage pour une analyse plus tard de l'AHL. Aux semaines 40 44, une partie de la culture de boues floculaires du SBR a été recueillie et utilisé pour semer une seconde SBR (6200 cm de diamètre). Le second SBR a fonctionné selon le premier SBR, avec quelques modifications, pour faciliter la formation de granulés microbiens (comme décrit précédemment en détail) .19 En bref, le second SBR a fonctionné à un temps de rétention hydraulique de 12h et le temps de décantation pour Chaque cycle a été réduit de 60 à 5 min dans les 5 premières semaines de fonctionnement du réacteur.19 Les granulés ont donc été définis comme des agrégats compacts avec un diamètre de particule minimal de 100 m et un indice volumétrique des boues (SVI5, une mesure de la densité / compacité de la biomasse) de 50 ml / G ou moins, 19,27 tandis que les flocons étaient une biomasse partiellement agrégée avec un diamètre de particule de 100 m ou moins et un SVI5 d'au moins 50 ml / g.
Souches bactériennes et conditions de croissance Les biosensors AHL incluant Agrobacterium tumefaciens A136,28 Chromobacterium violaceum CV026 (réf. 29) et Escherichia coli pJBA357,30 ainsi que P. aeruginosa MH602 (réf. 31) et E. coli JM109 (réf. 32) étaient de routine Maintenu dans Luria Bertani moyen. Les antibiotiques suivants ont été complétés dans le milieu de croissance chaque fois que nécessaire: tétracycline (4,5 g / ml), spectinomycine (50 g / ml), kanamycine (50 g / ml), ampicilline (100 g / ml) ou gentamycine (40 g / ml). Les génotypes de ces souches bactériennes sont énumérés dans le tableau complémentaire S1. Des échantillons ont été prélevés de chaque microcosme à différents moments, et la biomasse des boues a été éliminée par centrifugation (10min, 8000 g). Les AHL résiduels dans le surnageant de boues ont été extraites et quantifiées par spectromètre de masse tandem en chromatographie liquide à haute performance (Shimadzu, Singapour) comme décrit ci-dessous. Les boues inactivées par la chaleur et les contrôles SWW ont été inclus. L'adsorption des AHL à la biomasse des boues a été déterminée en comparant les AHL résiduelles dans le SWW et les contrôles des boues inactivées par la chaleur, immédiatement après l'addition, ainsi qu'après 1 heure d'incubation. Le pH de chaque microcosme de boues (liquide en vrac) a été surveillé tout au long de l'étude et a varié entre 6,7 et 6,9. L'impact du pH sur l'intégrité des AHL a également été évalué en ajoutant des AHL synthétiques à SWW tamponnés à différentes valeurs de pH allant de 6,7 à 8,3. Les courbes de régression linéaires et non linéaires ont été modélisées à l'aide de Prism (GraphPad, San Diego,replique rolex oyster perpetual or, CA, USA). La demi-vie du signal a été estimée en fonction de la cinétique zéro et du premier ordre.33
Détection et quantification des AHL par spectrométrie de masse tandem en chromatographie liquide à haute performance (LC MS / MS) La détection et la quantification des AHL provenant des effluents traités par les bioréacteurs ou des surnageants de boues ont été menées comme décrit par Tan et al.19 En bref, les AHL ont été extraits et concentrés à partir des Surnageants en utilisant du dichlorométhane (Sigma Aldrich). Les extraits de dichlorométhane ont été analysés et quantifiés à l'aide d'un spectromètre de masse tandem en chromatographie liquide à haute performance (Shimadzu LCMS8030, Shimadzu). Tous les échantillons ont été chromatographiés par chromatographie liquide à haute performance (colonne Shim pack XR ODS C18) à un débit de 0,3 ml / min. La phase mobile consistait en un gradient linéaire (40 95%) du solvant B (méthanol avec 0,1% d'acide formique) et du solvant A (formiate d'ammonium 25 mM avec 0,1% d'acide formique). Les effluents ont été ionisés par ionisation par électrospray en mode positif et détectés à l'aide de l'approche de la surveillance de la réaction multiple.14,34 Des expériences de surveillance de réaction multiple associées à la matrice ont été menées pour toutes les AHL.19 Chaque profil de surveillance de la réaction multiple standard, y compris le temps de rétention de la chromatographie liquide spécifique (LC) , L'apparition de l'ion précurseur m / z et deux ions de transition, ainsi que l'intensité relative des deux ions de transition, a été utilisée comme référence. Pour confirmer l'identité des AHL putatives, un balayage complet allant de m / z 100 à 350, couplé au mode de balayage ionique précurseur, a été effectué par rapport aux AHL standard.14 Pour la quantification AHL, des courbes standard matricielles allant de 0,5 À 200g / l, ont été construits. Deux ions de transition, caractéristique des AHL respectifs, ont été utilisés pour identifier l'AHL, et l'ion de transition avec la plus haute intensité a été utilisé pour construire les courbes standard. Les zones de pointe de l'analyte ont été intégrées à l'aide de LabSolutions (Shimadzu). Les limites de détection et de quantification pour chaque AHL ont été calculées avec un rapport signal / bruit de 3,3 et 10 respectivement14. La quantité de chaque AHL putative dans l'échantillon a été calculée en fonction de la courbe standard et de l'efficacité d'extraction de l'AHL respectif. L'efficacité d'extraction pour chaque AHL a été calculée en fonction de la récupération des AHL standard ajoutés à 5 et 50 g / l à la matrice d'échantillon surnageant de boues inactivées par la chaleur. Des injections vierges ont été effectuées aux intervalles d'injection d'échantillons pour éviter le report de l'échantillon.
Isolation des membres de la communauté des boues Au total, cinq expériences indépendantes d'isolement ont été réalisées à partir des semaines 40 à 44 de l'opération du bioréacteur. Chaque fois, 20 ml d'échantillons de boues uniformément mélangées ont été prélevés sur le bioréacteur à la fin d'un cycle opérationnel. Les échantillons de boues ont été vortexés vigoureusement pendant 5 minutes pour disperser les cellules floculaires, dilués en série et étalés sur les milieux de culture suivants: bouillon nutritif, R2A, isolation de Pseudomonas, SWW et ABT35 supplémentés avec 1,5% (p / v) d'agar chacun. Les plaques ont été incubées à 22 ° C pendant 5 jours. Le test biologique Tumefaciens A136, l'agar-indicateur ABT agar35 avec 50 g / ml de 5 bromo 4 chloro 3 indolyl b D galactopyranoside (X gal) a été préparé, tandis que la gélose Luria Bertani a été utilisée pour l'essai biologique CV026 de C. violaceum. Dix microlitres de cultures nocturnes de biosensors ont été repérés sur les plaques indicatrices, tandis que 10 l de cultures d'isolats d'une nuit ont été placés à 5 mm de l'endroit du biocapteur et incubés à 30 ° C pendant 48 heures. Les AHL produites in situ ont été détectées à l'aide du biosensor E. coli JBA357. En bref, 100l de 5 E. dilué pendant 4 h avant l'examen par microscope à balayage laser confocal (Zeiss LSM 710, Carl Zeiss Pte. Ltd., Singapour) à une longueur d'onde d'excitation / émission de 488/522 535 nm. E. coli JM109, P. aeruginosa MH602 et AHL synthétiques ont été inclus comme témoins. Pour 2h. Après la centrifugation et la stérilisation ultraviolette, les AHL résiduels ont été quantifiés à l'aide de l'essai biologique A. tumefaciens A136.38,39 En bref, six barres d'agar de 1 cm chacune ont été sécréties de manière aseptique à partir des plaques témoins ABT. Cinq microlitres d'échantillons ont été repérés à une extrémité des barres d'agar. Environ 0,5l de culture de nuit de A. tumefaciens A136 a été repéré progressivement à d'autres distances des échantillons chargés. Les plaques ont été incubées à 30 ° C pendant 24h. Les AHL ont été ajoutés à Luria Bertani à pH 6,7, 7,2 et 10,2, et les cultures de E. coli JM109 ont été incluses comme témoins. Le pH de toutes les cultures de nuit a été déterminé pour être l'analyse de séquençage d'ARN. L'ARN total a été extrait de boues en utilisant FastRNA Pro Soil Direct kit (MP Biomedicals, Singapour) selon les directives du fabricant. L'ARN extrait a été soumis à un prélèvement d'ADN en utilisant le kit TURBO DNA free (Applied Biosystems). L'ARN total, 200 nd, a été utilisé pour la préparation complémentaire de la bibliothèque d'ADN selon les instructions du fabricant (Illumina, Singapour). Chaque bibliothèque d'ADN complémentaire a été ligaturée avec une séquence d'adaptateur unique pour le multiplexage d'échantillon. Au total, 16 bibliothèques d'ADN complémentaires différentes ont été regroupées et séquencées par MiSeq System (Illumina). Les données de séquençage de l'ARN ont été analysées à l'aide d'une méthode à balise rapide comme décrit.19 En bref, une amorce universelle (5 CGACRRCCATGCANCACCT 3) pour la région hypervariable 16S rARN (V6) a été utilisée pour analyser chaque séquence de lecture pour obtenir les 33 séquences d'étiquettes nucléotidiques en aval De l'amorce, et les 33 séquences nucléotidiques sont définies comme la marque V6 du gène 16S rRNA. L'amorce universelle correspond à 94% des séquences d'ARNr 16S dans la base de données RDP.41 Pour éliminer les marques V6 dérivées d'erreur de séquençage, seules les balises V6 qui ont été observées dans au moins deux lectures différentes ont été conservées pour analyse. En outre, les étiquettes V6 ont été supprimées lorsqu'un seul type de lecture séquentielle représentait 50% de toutes les lectures couvrant cette étiquette V6. Cela a été fait pour éliminer les artefacts de séquençage où des lectures doubles identiques ont été générées à partir de modèles uniques. Les tests de comparaison multiple de Holm Sidak ont été effectués pour comparer les demi-vies d'AHL dans différents échantillons ou pour examiner l'expression de l'AHL entre différents échantillons de boues. Les coefficients de corrélation de Pearson ont été déterminés et de fausses corrections de taux de découverte ont été faites pour toutes les corrélations multiples. Ont été regroupés en utilisant une méthode de clustering hiérarchique non supervisée basée sur la distance Euclidienne avec une liaison complète codée par Cluster 3.0 et visualisée à l'aide de Java TreeView (Open Source Clustering Software, Tokyo, Japon).
Résultats La communauté de boues floculaires dégrade les AHL différentiellement en fonction de la longueur de la chaîne acylique. Un bioréacteur communautaire hautement diversifié de boues floculaires subissant une nitrification simultanée, une dénitrification et une élimination du phosphore a été utilisé comme système expérimental (figure supplémentaire S1). Pour déterminer si l'activité QQ spécifique de l'AHL était présente dans ce système modèle, les AHL synthétiques ont été ajoutés individuellement ou en mélange aux boues floculaires pour caractériser les taux de dégradation du signal. Environ 10 30% des AHL ont été perdus en raison de l'adsorption à la biomasse, tandis que la perte des 70 90% restants du signal a été attribuée à l'activité biologique (Figure supplémentaire S2). Ceci était évident par les demi-vies AHL sensiblement plus courtes en présence de boues vivantes que lorsqu'elles étaient incubées en présence de boues inactivées par la chaleur (PFigure 1). En présence de boues vivantes, la demi-vie du signal était inversement proportionnelle à la longueur de la chaîne acylique, indépendamment de la substitution en position C3 (Figure 1). Par exemple, la demi-vie pour les signaux à chaîne courte C6 HSL et 3OC6 HSL était respectivement de 1.950.45 et 2.570.29h, alors que les demi-vies des signaux à chaîne longue C12 HSL et 3OC12 HSL étaient considérablement plus courtes à 0.790.08 et 0.660. 06h, respectivement. Le pH du microcosme des boues vivantes était cohérent à 6,7 6,9 et les données pour les contrôles tampons SWW indiquaient qu'il y avait une faible dégradation spontanée des AHL entre des valeurs de pH de 6,7 8,3 (figure supplémentaire S3). Par conséquent, il est probable que la perte d'AHL observée ici est due à une digestion enzymatique active plutôt qu'à une dégradation chimique passive.
Figure 1 Dégradation des lactosacérases d'homosérine N (AHL) en fonction de la fonction de la longueur de chaîne acyl dans les boues floculaires. La valeur de dégradation est exprimée en demi-vie de signal. Un mélange d'acides gras non substitués (a) et oxo-substitués (b) a été ajouté aux boues vivantes (cercle ouvert) ou à la chaleur inactivée (cercle solide) à une concentration finale de 5 M pour chaque AHL. Le pH de chaque mélange de boues (liquide en vrac) a été surveillé tout au long de l'étude et variait entre pH 6,7 et 6,9. Les AHL résiduelles ont été extraites et quantifiées à l'aide de LC MS / MS à différents moments. La demi-vie du signal pour chaque AHL a été estimée en fonction de la cinétique de l'ordre zéro ou du premier ordre. (N = 3, répliques biologiques). Des tests t multiples de Holm Sidak ont été effectués (contrôle inactivé en fonction de la durée de vie par rapport à la chaleur pour chaque AHL) et des valeurs de P corrigées (P
Une proportion significative des membres de la communauté des boues floculaires produisent ou calment les AHL afin de mieux comprendre les relations entre la spécificité de l'activité QQ et la production de signal dans la communauté des boues floculaires, 307 souches de bactéries et 23 souches de champignons, correspondant à 50 bactéries Et quatre genres fongiques ont été isolés et testés pour leur capacité à produire ou à dégrader les AHL (Tableau supplémentaire S2). Les isolats bactériens représentaient 3,5% des membres de la communauté totale identifiés par séquençage de l'ARN (tableaux supplémentaires S3 et 4). La production d'AHL a été principalement évaluée en fonction de l'activation de différents biosensors, y compris E. coli JBA357,30 A. tumefaciens A13628 et C. violaceum CV026.29 Le profil AHL de chaque producteur de signal putatif a ensuite été déterminé en utilisant LC MS / MS. La dégradation de l'AHL a été testée en utilisant des AHL avec des chaînes acyle courtes (3OC6 HSL), moyenne (3OC8 HSL) et lonely (3OC12 HSL). Une grande proportion d'isolats de boues floculaires, soit 65%, étaient des producteurs de signaux AHL ou des extincteurs (figure 2). Bien que seulement 10% des isolats puissent produire des AHL, jusqu'à 58,1% des isolats ont réussi à étancher au moins une des AHL examinées. Une proportion relativement faible des isolats,rolex oyster femme contrefaçon, de 4,8%, a produit et désactivé des AHL. Les 36,7% restants des isolats n'ont ni produit ni désactivé les AHL. Tous les extincteurs AHL étaient capables d'inactiver l'AHL à longue chaîne, 3OC12 HSL. Bien que 77% des extincteurs n'aient pu que dégrader les AHL à longue chaîne, 23% pourraient dégrader les AHL à longue chaîne ainsi que les AHL à chaîne courte ou moyenne.
Figure 2Distribution des isolats en fonction de leur capacité à produire et / ou énerrer les lactones homosérine N acyl (AHL). Au total, 330 isolats, dont 307 et 23 souches d'origine bactérienne et fongique,rolex datejust 2 fond noir faux, ont été cultivés à partir de la communauté des boues floculaires pendant l'opération du bioréacteur à partir des semaines 40 44. Tous les isolats ont été criblés pour la production d'AHL par différents bilans biologiques et LC MS / MS , Ainsi que pour leur capacité à étancher 5M d'AHL avec des chaînes d'acyle courtes (3OC6 HSL), moyennes (3OC8 HSL) et longue (3OC12 HSL) après 2h d'incubation. Les AHL résiduels ont été quantifiés à l'aide de l'essai biologique à base d'agar A. tumefaciens A136.Les membres de la communauté AHL qui trempe sont p
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